病毒性肝炎树鼩动物模型研究与建模策略

庞义全，冯悦，孙晓梅，刘丽，代解杰，夏雪山

(1.昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明 650500;2.中国医学科学院医学生物学研究所，昆明 650118)

病毒性肝炎严重危害人类的健康，据世卫组织最新数据显示，全球约有20 亿人感染肝炎病毒(包括病毒携带者和患者)，每年约有80～100 万人死于病毒性肝炎感染相关疾病。我国属于肝炎的中度流行区，每年有超过130 万人感染病毒性肝炎，占传染病总数的1/3。由于合适的动物模型的缺乏，诸如丙型肝炎等感染性高的病毒性肝炎类型，至今尚无有效的疫苗和可治愈策略［1］。人和黑猩猩是多种肝炎病毒的自然宿主，但黑猩猩数量稀少、价格昂贵以及伦理道德等原因，很难用于模型研究。研究者多用小鼠来研究肝炎病毒，并通过转基因及肝细胞移植等手段提高小鼠对病毒的感染性，但由于小鼠与人类亲缘关系差距较大，病毒感染后的病理变化机制也存在较大差异，即使病毒可有效感染，并未产生典型的肝炎症状［2］。最近研究显示，树鼩可以感染乙型、丙型等肝炎病毒，因而也就为其发展成为病毒性肝炎动物模型提供了可能［3］。本文就病毒性肝炎树鼩模型研究情况及可能的建模策略作一综述。

1 病毒性肝炎

病毒性肝炎是由肝炎病毒引起的肝脏疾病，肝炎病毒都以肝细胞作为宿主细胞，主要通过病毒感染和免疫病理变化侵害肝组织，临床表现为急慢性肝炎、肝硬化、乃至肝癌。肝炎病毒主要有甲型、乙型、丙型、丁型、戊型等五种病毒，分别属于不同病毒科，具有不同的生物学特性(表1)。

表1 各型肝炎病毒及特点Tab.1 Different hepatitis viruses and their characteristics

甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒属于粪－口传播的爆发型流行病毒，主要表现为急性感染，极少数会转为慢性化。随着医疗卫生条件改善，甲型和戊型肝炎感染与发病率显著下降。丁型肝炎病毒是一种缺陷病毒，只能在嗜肝性DNA 病毒辅助下才能复制。乙型肝炎病毒属于嗜肝性DNA 病毒，主要通过血液、母婴以及其他体液传播，感染后容易产生慢性化。我国是乙型肝炎患病人数最多的国家，约有1.2 亿人携带HbsAg［4］。丙型肝炎病毒属于黄病毒科单股正链RNA 病毒，我国目前大约有4300 万人感染丙型肝炎病毒，其传播途径与乙型肝炎病毒类似。至今，对乙型肝炎和丙型肝炎都尚无有效的治疗方式，主要原因在于缺乏合适的动物模型来进行病毒致病机理研究和疫苗、药物研发。

2 病毒性肝炎模型研究近况

除人之外，只有黑猩猩是多种肝炎病毒的自然宿主，感染后表现出与人类相似的疾病症状，是最为合适的肝炎病毒动物模型，但由于其属于濒危动物、价格昂贵及伦理道德原因，难以广泛使用。甲型肝炎动物模型主要有鹰猴模型［5］、豚鼠模型［6］、白须狨猴模型［7］、普通狨猴模型［8］和食蟹猴动物模型［9］等。豚鼠模型已被用甲肝发病机制研究和疫苗的评价;白须狨猴模型也被用于甲型肝炎疫苗开发;甲型肝炎病毒口服接种狨猴，在粪便中可检测到HAV RNA，可用于疫苗保护性和抗病毒药物试验。丁型肝炎动物模型主要有土拨鼠模型［10］、人源化uPA/SCID 小鼠模型［11］和移植肝细胞小鼠模型［12］。土拨鼠动物模型可用于HDV 感染后发病机制研究及疫苗开发;人源化uPA/SCID 小鼠模型已被用于抗病毒药物的临床前药物评价;移植肝细胞小鼠模型更多用于感染发病机制研究。戊型肝炎动物模型主要为食蟹猴［13］、非洲绿猴［14］等非人灵长类动物，已用于发病机制研究和疫苗试验;另外，SD 大鼠［15］、猪［16］、兔［17］、沙鼠［18］等也可用于戊型肝炎病毒感染方面的研究。

乙型肝炎动物模型主要有鸭模型、土拨鼠模型和小鼠模型。由于鸭乙型肝炎病毒(DHBV)可感染鸭子，产生类肝炎症状，鸭模型可用于评价抗病毒药物治疗效果［19］。但由于鸭HBV 和人HBV 在结构上差别较大，不能很好的再现人HBV 感染过程。土拨鼠肝炎病毒(WHV)基因结构及致病特性等方面与HBV 类似，被该病毒感染的土拨鼠也被用于HBV 感染机制研究及疫苗开发［20］。HBV 小鼠模型主要为转基因小鼠模型(包括全基因组转染模型［21］、亚基因组转染模型［22］)、人鼠嵌合肝模型(NOD/SCID 小鼠模型［12］、uPA/SCID 小鼠模型［23］、MUP－uPA/SCID/Bg 小鼠模型［24］)以及水动力法转染小鼠模型［25］。转基因小鼠模型可以用于抗原耐受机制及致病机理研究，但很难用于病毒侵入、传播及抗病毒药物的研究。人鼠嵌合肝模型可以用于HBV 感染及肝癌发生机制的研究，但由于小鼠免疫特性与人相差较大，很难用于病毒后的免疫致病机制研究。水动力法转染模型则是通过水动力法将HBV DNA 快速注入到小鼠肝脏，使肝细胞感染HBV，并发现感染后症状，其一定程度上可用于HBV 复制周期研究及抗病毒药物筛选。

丙型肝炎动物模型主要有猴模型和小鼠模型。夏宁邵等［26］在猕猴体内植入人肝细胞，使猕猴可被HCV 感染，但很难用于HCV 致病机制的研究。最近，Sourisseau 等［27］将豚尾猴干细胞分化成的肝细胞，发现此细胞可支持HCV 感染和复制，为动物模型建立开创了新的途径。小鼠模型主要有转基因小鼠模型和肝移植小鼠模型。转基因小鼠是将HCV 结构基因或者HCV 受体基因转至小鼠体内，使小鼠具有对HCV 的易感性，可用于致病机理等方面的研究［28，29］，但由于免疫特性的种间差异，很难用于致病过程的研究。肝细胞移植小鼠模型则是将人肝细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内(如Trimera 小鼠模型［30］、uPA/SCID 小鼠模型［31］、MUP－uPA/SCID/Bg小鼠模型［24］)，可使HCV 病毒感染并支持其增殖，已用于HCV 感染与增殖特性研究及抗病毒药物筛选。

尽管灵长类及啮齿类在病毒性肝炎疾病动物模型的研究与应用方面已取得较大进展，但灵长类繁育难度大、操作繁琐、价格昂贵，而啮齿类动物与人之间较大的种间遗传差异，导致病毒的感染与致病特性也因此不同，急需寻找一种与人遗传与生理差距小，且易于获得的小动物模型。树鼩(Tupaia)被分类为哺乳纲、攀鼩类的小型哺乳动物，广泛分布于热带和亚热带地区，在我国主要分布在云南、广西、海南等地。树鼩个体小，繁殖快，易于获得，且生理机能和新陈代谢较啮齿类更接近于人类，已用于多种人类疾病模型研究，尤其因其能被HBV 和HCV 等肝炎病毒感染而备受关注。

3 树鼩作为病毒性肝炎模型研究近况

3.1 甲型、丁型、戊型肝炎病毒树鼩动物模型

Zhan 等［32］首次用树鼩进行甲型肝炎动物模型研究，用甲型肝炎患者粪便过滤物通过饲喂感染树鼩，在树鼩体内及排泄物中可检测到甲型肝炎病毒。丁型肝炎病毒属于缺陷型病毒，其复制需依赖于乙型肝炎病毒的辅助。Li 等［33］建立了丁型肝炎/乙型肝炎树鼩感染模型，并发现树鼩病理变化过程与黑猩猩感染类似，证实树鼩可以作为丁型肝炎动物模型。蒋雷等［34］用戊型肝炎病毒(HEV)静脉注射感染树鼩，7 天后可检测到血液中HEV RNA，并发现肝脏出现相关的病理变化，证实树鼩有可能成为戊型肝炎动物模型。

3.2 乙型肝炎病毒树鼩动物模型

早在1984 年，严瑞琪等［35］用人HBV 阳性血清分别经静脉和腹腔注射感染树鼩，感染后检测显示，7/10 只树鼩血清出现HBsAg 阳性，首次表明树鼩可被HBV 感染。随后，Walter 等［36］用HBV DNA 阳性血清感染树鼩原代肝细胞及新生、成年树鼩，原代肝细胞在感染后5～6 d 能检测到HBsAg 和HBeAg;新生树鼩在感染后2～4 周能检测到HBsAg以及多种特异性抗体，并出现类似人的急性肝炎症状，但10 只成年树鼩感染后仅表现为一过性感染。Wang 等［37］用HBV 阳性血清感染新生树鼩，46 只新生树鼩中有6 只建立了慢性感染，且出现类似乙型肝炎症状及相应的组织病理变化，说明树鼩模型可用于进行乙型肝炎病程和致病机制研究。Ren等［38］用重组的Ad－HBV1.3 和AdGFP－HBV1.3 病毒感染树鼩原代肝细胞，能检测到HBsAg、HBeAg、HBV DNA 和HBV 包膜蛋白的表达。曾扬等［39］利用重组腺相关病毒为载体使HBV 全基因在树鼩肝脏中表达，建立了HBV 急性感染树鼩动物模型。最近，Ping 等［40］用HBV 阳性血清感染新生树鼩发现，树鼩可以被HBV 感染，肝组织出现与乙型肝炎患者类似的病理变化。以上结果显示，树鼩可以被HBV感染，并且出现典型的感染症状与病理变化，有望成为理想的乙型肝炎动物模型。

3.3 丙型肝炎树鼩动物模型

1998 年，刘志等［41］就用HCV RNA 阳性血清静脉注射感染成年树鼩，可以在被感染动物血清中间歇性检测到HCV RNA，首次发现树鼩可能对HCV易感。同时，Xie 等［42］用HCV 1b 型阳性血清感染23 只树鼩，发现8 只树鼩出现间歇性感染，而用1a、1b、3 型HCV 混合血清感染树鼩，发现经辐照树鼩出现持续病毒血症，进一步证实树鼩可以被HCV 感染。Zhao 等［43］用丙型肝炎患者血清感染树鼩原代肝细胞，收取上清进行传代培养，两次传代均能在培养上清中检测到HCV RNA，并在其中发现HCV 病毒的准种变化，证实体外培养的树鼩原代肝细胞也可以被HCV 感染并支持其复制。Xu 等［44］用1b、2c、3b 和6 型四种基因型混合的HCV 血清感染树鼩，18 只树鼩有16 只被感染，其中12 只建立了慢性感染。Amako 等［45］用培养HCV 病毒和临床病毒株感染树鼩，经长达三年的连续观察，发现树鼩可以建立慢性感染，感染树鼩会出现间歇性病毒血症、肝脂肪变性、肝脏纤维化及肝细胞癌等组织病理学变化。尽管由于树鼩来源不同及种系差别大、遗传不稳定等因素，导致树鼩对HCV 感染率不稳定，不同研究发现的感染与致病现象也不尽相同，但已有报道均可确定树鼩可以被HCV 感染，并且出现慢性肝炎相关症状，有望成为合适的丙型肝炎动物模型［46］。

4 肝炎病毒对树鼩感染与致病的宿主影响因素

病毒对宿主的感染及致病除受到病毒基因所决定的感染力与致病性等病毒因素外，还受到细胞内小RNA、病毒感染细胞表面受体及其他宿主影响因素影响(见图1)。

4.1 细胞内小RNA

细胞内小RNA(miRNA)是一类长约21 到23个核苷酸的非编码单链RNA 分子，参与转录后基因表达调控。miRNA 通过与信使RNA 特异结合，从而抑制转录后基因表达，并且miRNA 在病毒感染中起到一定作用。在诸多的miRNA 中，与HCV 感染有关的主要有miR－122、miR－199a* 、miR－29 和miR－27a 等。miR－122 在HCV 感染中起到至关重要的作用，能够促进HCV RNA 的复制［47］;上调miR－199a* 、miR－29 或miR－27a 则可抑制HCV 在细胞中的复制［48－50］。而与HBV 有关的miRNA 主要有miR－122、miRs－372/373、miR－501、miR－141 和miR－155等。miR－122 在HBV 感染树鼩肝细胞后发现表达量提高［51］;miRs－372/373 通过靶向核因子I/B 促进HBV 的表达［52］;miR－501 能够促进HBV 的复制［53］，相反miR－141 则能抑制HBV 的复制［54］;miR－155 能够提高机体的免疫，从而抑制HBV 的感染［55］。不同种类的miRNA 在肝炎病毒感染及复制过程中具有不同的作用。

4.2 肝炎病毒受体分子

肝炎病毒必须通过与宿主细胞表面受体分子结合，才能完成病毒对宿主细胞的感染。目前，乙型、丙型肝炎病毒受体研究已有了较大进展。

HBV 受体研究从70 年代就已开始，早期认为多聚人血清白蛋白(PHSA)［56］、细胞因子修饰的血清蛋白(MSA)［57］、HBV 结合因子(HBV BF)［58］、p80 蛋白［59］、白介素－6(IL－6)［60］、多聚IgA 受体［61］以及人肝细胞附加素［62］都可能是HBV 受体。也发现多种细胞表面游离分子可与HBV 相结合，可能参与介导HBV 对肝细胞的感染，但这些分子对介导感染特性与分子机制仍不清楚。李文辉等［63］在HBV感染树鼩原代肝细胞中发现，牛黄胆酸钠共转移多肽(NTCP)可与HBV 前S1 蛋白域结合。把人或树鼩NTCP 转染HepG2 细胞，使其具有对HBV 易感，沉默肝细胞中的NTCP 则降低HBV 对肝细胞的感染，证实NTCP 是HBV 感染细胞的受体。牛黄胆酸钠共转移多肽(NTCP)是一种具有胆酸转运功能的多肽类物质，主要负责肝脏内的胆酸转运，其作为乙型肝炎病毒细胞受体新功能确定，对动物模型的建立研究、靶向药物的研发起到重要的推动作用。

HCV 通过宿主细胞的多种表面蛋白分子介导感染肝细胞，已确定的受体主要包括四次跨膜素成员CD81［64］、B 族I 型清道夫受体SR－BI［65］、细胞紧密连接蛋白 claudin－1(CLDN1)［66］和 occludin(OCLN)［67］，氨基葡聚糖(GAGs)、低密度脂蛋白受体(LDLr)、凝集素分子(DC－SIGN 和L－SIGN)等其他分子也有一定的感染辅助作用。CD81 是四次跨膜蛋白家族成员，其大胞外环是介导HCV 感染的关键区域。我们克隆了树鼩CD81 分子基因，经序列测定与分析发现，树鼩CD81 分子与人氨基酸序列同源性高达96%，与E2 结合的关键氨基酸位点树鼩和人完全一致［43］。SR－BI 是另一种介导HCV 进入细胞的受体分子，树鼩SR－BI 与人的氨基酸序列同源性为88%，Barth 等［68］将树鼩SR－B1 基因转入CHO 细胞中，证实树鼩SR－B1 可与E2 蛋白结合，并介导病毒入胞。Claudin－1 作为介导HCV 入胞的受体分子，树鼩claudin－1 和人的该分子氨基酸序列同源性达93%，Tong 等［69］发现树鼩claudin－1 可提高细胞对HCVpp 的易感性。树鼩occludin 分子和人的氨基酸序列同源性为88%，与HCV 结合关键区域的45 个氨基酸位点仅有4 个与人不同，将树鼩occludin分子与人CD81、SR－BI、claudin－1 分子共转染NIH3T3可高度介导HCVpp 对细胞的感染［69］。以上结果，从HCV 受体序列同源性和介导功能的角度，佐证了树鼩对HCV 易感，可以成为HCV 动物模型。

4.3 其他宿主影响因素

肿瘤坏死因子－α 是一种系统性炎症细胞因子，具有调节免疫细胞的功能。Xu 等［70］发现肿瘤坏死因子－α 的表达可抑制HBV 在肝细胞中的复制，不利于HBV 的感染。p53 基因可修复DNA 损伤，抑制细胞周期或诱导凋亡。Lee 等［71］发现p53 可抑制HBV 的复制，李强等［72］也发现HCV 的核心蛋白可与p53 相互作用。超氧化物歧化酶是一种能够催化超氧化物转化为过氧化氢，具有抗氧化作用，而谷胱甘肽S－转移酶是谷胱甘肽结合反应的关键酶。Li等［73］发现铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)及谷胱甘肽S－转移酶A1 基因(GSTA1)在肝炎患者中表达水平显著下调。NF－κB 为一个转录因子蛋白家族，参与免疫反应的早期和炎症反应分子的调控，Guitart等［74］发现HCV 感染原代肝细胞后可下调NF－κB基因的表达。

图1 调控病毒感染树鼩Fig.1 Regulation of the viral infection in tree shrew

5 病毒性肝炎树鼩建立策略

已有研究结果表明，树鼩可以感染HBV 和HCV，但树鼩对HBV 和HCV 病毒感染率低，不能达到稳定感染。通过借鉴现有病毒感染率提高及基因操作、异种动物建模技术，我们可以在树鼩和病毒两方面进行改造和优化，来提高病毒对树鼩的感染性，以实现最终建立病毒性肝炎树鼩动物模型。

5.1 树鼩个体的改造与优化

肝炎病毒能自然感染人和黑猩猩，主要原因可能在于肝炎病毒对人和黑猩猩肝脏环境的适应性。我们可以通过异种移植的方式，将人肝细胞移植到动物体内，为病毒提高合适的感染与复制环境，以提高病毒的感染性。比如，Tesfaye 等［24］将人肝细胞移植到MUP－uPA/SCID/Bg 转基因小鼠上，发现人肝细胞可在小鼠肝脏内生长。这种肝细胞移植小鼠可以提高HBV 和HCV 的感染。Kosaka 等［75］发现TK－NOG 小鼠(基于胸腺激酶的小鼠)在注射鸟嘌呤后可支持人肝细胞的移植，并能对HBV 和HCV 易感，并可建立稳定的感染，且能出现病毒血症。而Ilan 等［30］则用无免疫系统的正常小鼠与SCID 小鼠骨髓细胞进行重构，再将感染了HCV 的人肝细胞移植到鼠肝内建立HCV 三聚体小鼠，发现HCV 感染率高达80%，并且在肝细胞中可检测到HCV 负链的存在。这些鼠类肝细胞移植模型可提高病毒的感染与复制，而我们可借鉴这些建模策略，比如可以构建成MUP－uPA/SCID/Bg 转基因树鼩和TK－NOG 树鼩，再将人肝细胞移植到经过改造的树鼩体内，有望提高病毒对树鼩的感染性。或者直接将患有肝炎病毒的人肝细胞移植到免疫缺陷型的树鼩体内，构建成类似的三聚体树鼩，提高病毒感染性。通过此方式将有希望建成HBV 和HCV 高感染的树鼩动物模型。

牛黄胆酸钠共转移多肽(NTCP)已被证实是HBV 的受体，CD81、SR－BI、CLDN1 和OCLN 则是HCV 进入细胞的受体，受体基因的高表达有助于相应病毒对宿主细胞的感染。比如Dorner 等［76］用基因工程技术在小鼠体内表达人CD81 和OCLN，发现该小鼠对HCV 易感。我们也可以借助基因工程技术在树鼩肝组织中高表达人HBV 和HCV 的相应受体分子，借助受体分子的表达来提高肝炎病毒对树鼩的感染与致病性。

细胞内存在着病毒复制的正调节因子及负调节因子，正调节因子的存在可提高病毒在细胞内的复制及释放，比如miR－122 可提高HCV 的翻译和复制［47］。而负调节因子则可能在动物体内参与提高体内的抗病毒反应，使病毒蛋白失活导致对细胞感染性下降，比如HCV 在PKR 缺失的鼠胚胎成纤维病毒细胞的复制远远大于在正常成纤维细胞中［77］。因此，我们可以借助基因工程手段，提高细胞中与病毒感染及复制有关的正调节因子的表达、降低或沉默负调节因子的表达，来提高病毒对树鼩的感染与致病性。

5.2 病毒的改造与优化

筛选获得对异种动物的适应性病毒株，有助于提高病毒的感染、致病性和疾病模型的建立。已有研究已利用细胞传代筛选、病毒基因改造等技术筛选出适应性HCV 病毒株，提高了病毒对小鼠与狨猴的感染性。比如Bitzegeio 等［78］用高表达鼠CD81的Lunet N 细胞连续传代HCV 病毒，筛选到可利用鼠CD81 感染细胞的HCV 病毒适应株，并证实由于囊膜蛋白与P7 蛋白的部分氨基酸发生了变异，使病毒获得对异种细胞感染能力。我们可借鉴此方法，用树鼩CD81 在Lunet N 细胞中表达，筛选出适应树鼩CD81 的HCV 病毒株，并用适应性病毒株在树鼩原代肝细胞经连续传代培养，进一步优化病毒，有望提高肝炎病毒对树鼩的感染性和致病性。

Li 等［79］采用基因工程技术将HCV 的核心和包膜蛋白或者是完整的膜蛋白替换为GBV－B 对应基因片段，构建了HCV/GBV－B 嵌合病毒，使嵌合病毒具备了对GBV－B 自然宿主狨猴的感染性。因此，我们也可以利用与肝炎病毒同类并且可以自然感染树鼩的病毒，构建嵌合病毒，提高肝炎病毒对树鼩的感染性。

病毒在树鼩体内不能稳定感染的主要原因可能还在于病毒不能适应树鼩肝细胞的环境，导致病毒在细胞中复制较低，不能产生稳定的感染性病毒。我们可以开发出体内选择系统，来提高病毒的复制能力。有研究报道，在病毒基因组中嵌入FAH 选择标记基因，与FAH 缺失小鼠可产生互补的选择性，通过选择压力，促使病毒基因组在FAH 缺失小鼠肝细胞内复制，提高病毒的感染性［80］。我们也可将树鼩肝细胞中FAH 基因敲出，利用病毒与细胞的互补选择性提高病毒在树鼩肝细胞中的复制，来提高病毒对树鼩肝细胞的感染性。

6 展望

疾病动物模型对于研究病原体感染与致病机制，以及药物与疫苗的研发均具有重要意义。理想的动物模型应能使病毒易于建立感染，产生与人类感染相应肝炎病毒相同、至少相似的疾病过程与症状。从分子水平来看，树鼩的HBV 和HCV 受体与人同源性高，尤其是关键结合位点高度一致，并可介导病毒的感染，为树鼩发展成为合适的动物模型提供了良好的佐证。目前为止，虽然树鼩对于HBV、HCV 感染率仍较低，难以建立慢性感染，但随着分子生物学、免疫学、病毒学、基因工程技术及细胞培养技术的发展，树鼩有望发展成为合适病毒性肝炎动物模型，为这些疾病感染与致病机制研究、药物与疫苗研发提供技术支撑。

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