慢性束缚应激对SD和Wistar大鼠学习记忆能力的影响

王逸，卢聪，宋广青，陈怡西，武宏伟，王琼,，曲丽娜，李莹辉，刘新民

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；

2.泸州医学院，泸州 646000；

3.中国航天员科研训练中心航天医学基础与应用国家重点实验室，北京 100094)

应激是人类所处生活环境中普遍存在的一种外界因素[1]。当今社会，生活节奏加快、工作压力增加，生活环境的改变，使人们暴露于应激事件的频率和时间都明显增加[2]。长时间的慢性应激导致的情绪障碍和认知功能损伤，严重影响了人们的生活质量[3-5]。本实验通过行为制动的束缚应激方法造模，选用国内常用的SD、Wistar大鼠为研究对象，采用不同的行为学方法评价动物的学习记忆能力，以期为应激认知损伤动物模型建立、机制研究以及防护药物的研发中实验动物品系的选择提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验仪器

大鼠行为限制器 (北京鑫海华仪公司，中国)、大鼠水迷宫计算机监测分析系统(中国医学科学院药用植物研究所、中国航天员科研训练中心、北京三维拓盟数字影像技术有限公司)、物体识别检测箱(中国医学科学院药用植物研究所、北京鑫海华仪公司)。

1.1.2 实验动物

SPF级SD、Wistar雄性大鼠，各12只，190 ～210 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供【SCXK(京)2012-0001】。实验在中国医学科学院药用植物研究所进行【SYXK(京) 2008-0019】，照明系统人工控制12 h/12 h明暗循环(亮灯8：00-20:00，熄灯20:00-次日8:00)，动物分笼饲养，每笼2～4只，适应期间自由饮食饮水。本实验遵循实验动物伦理原则。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组

适应性饲养3d后，随机分为4组，Wistar、SD各2组，每组6只。分别为Wistar 28 d对照组、Wistar 28 d模型组、SD 28 d对照组、SD 28 d模型组。

1.2.2 慢性束缚应激模型的建立

根据文献报道[6-7]，将造模大鼠置于长约12～16 cm(可调节)，内径约6 cm的聚酯透明圆柱管内，四肢制动，只允许头部轻微活动，同时行为限制器顶部有5～6个直径1 cm左右的通气小孔供动物呼吸用，每天束缚10 h(22:00-次日8:00)。束缚期间各组禁食禁水，其余时间自由饮食饮水。连续束缚28 d后，进行行为学检测。

1.2.3 体重检测

大鼠于分组前称重一次。分组后，对4组动物进行体重的监测和记录，称重均在下午进行，每7 d称重一次并记录。

1.2.4 水迷宫空间记忆

水迷宫实验方法与文献报道相似[7]。本实验中，圆形迷宫直径为159 cm、高50 cm，池中水深25.5 cm左右，内置平台直径 9 cm、高24 cm，水温维持在(24±1)℃。将迷宫置于空间信息相对丰富的实验环境中，作为动物学习过程中的空间参照物，整个试验周期内保持环境信息固定不变。将迷宫均分为4个象限，将平台置于其中一个象限中央，作为实验中动物逃离水环境的唯一途径，空间记忆阶段保持平台位置固定不变。选择其余3个象限作为动物的入水点将动物面向池壁放入水中，每天训练3次，每次变换入水点位置(使动物可分别从3个象限入水)，且每天所有动物入水点的顺序保持一致。每次训练前适应10 s，使动物获取并学习空间环境信息。设置检测时间为60s后，将动物放入水中，若动物在60 s内找到平台，算作寻台成功并记录其潜伏期，并使其在平台上停留休息10 s。若动物在60 s内未找到平台，结束此次训练并记录潜伏期为60 s，并引导动物靠近平台使其在平台上停留10 s。每只动物训练的时间间隔为40 min。每天每只动物3次训练学习的潜伏期平均值，作为评价动物这一天学习能力的指标。

经过5d的训练学习后，第6天撤去平台，进行空间探索实验。将动物从原平台象限的对角象限面向池壁放入水中，检测其在60s内在原平台象限的游程比、时间比，以及穿过原平台所在位置的次数，作为评价空间记忆能力的指标。

1.2.5 水迷宫工作记忆

空间探索实验结束次日，开始工作记忆实验[8]。工作记忆历时3d，分别将平台置于其余3个不同象限中，每天变换平台位置，同一天内平台位置保持不变。每天训练3次，依次从其余3个非平台象限将动物面朝池壁放入水中。训练前不予适应，其余同空间训练阶段一致。计算3天中，第2次训练潜伏期的平均值，作为评价动物学习记忆能力的指标。

1.2.6 新物体识别实验[9-10]

实验箱为黑色聚酯塑料材质构成的封闭箱，体积为60 cm × 40 cm × 80 cm, 箱体左右两侧各有两排LED灯条照明，既避免了强光直射对动物行为的干扰，又可以作为计算机对动物行为识别的背景光。顶部采用摄像头观察动物的活动情况及探索过程。实验过程分为3个阶段：适应期、熟悉期、测试期。适应期为3d，每天将动物依次放入实验箱内，熟悉环境10 min。适应期结束后，次日进行熟悉和测试。熟悉期时，将两个完全相同的物体放入实验箱内对称的位置处，此两物体距离侧箱壁、箱后壁的距离均为10 cm。记录大鼠5 min内对两物体的探索总时间。间隔30 min后，进入测试期。测试期内，将其中一个熟悉物体换为另一个大小相近但形状和颜色不同的新颖物体，记录大鼠对新颖物体和熟悉物体的探索时间，用辨别指数(discrimination index，DI)来评价动物的学习记忆能力。辨别指数计算公式为DI=(N-F) /(N + F) ×100%，其中N(new)为新颖物体探索时间，F(familiar)为熟悉物体探索时间。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 体重的结果

如表1所示，慢性束缚应激(10 h/d, 28 d)能显著抑制两种品系大鼠体重的增加。其中，与对照组相比，Wistar模型大鼠从束缚7d开始体重显著降低(P<0.001)。SD模型组体重的变化趋势与Wistar相似，即与对照组相比，从第7天开始束缚应激对SD大鼠体重的增加具有显著抑制作用。直到束缚第28天，两种品系大鼠体重依旧显著低于各自对照组(P<0.001)。

表1 慢性束缚应激对两种品系大鼠体重的影响(n=6，± s)

2.2 新物体识别实验结果

如表2所示，在新物体识别实验中，Wistar大鼠模型组与对照组在熟悉期的探索总时间没有显著差异；在检测期，模型组辨别指数(DI)为负值且低于对照组，但没有显著差异。慢性束缚应激对SD大鼠熟悉期的探索行为也没有产生显著影响[11]，即模型组与对照组探索总时间没有显著差异；而束缚应激使SD模型大鼠检测期的DI明显降低，且与对照组比差异性有显著(P<0.05)。

表2 慢性束缚应激对两种品系大鼠新物体识实验的影响(n=6，± s)

2.3 水迷宫空间学习实验结果

慢性束缚28d后的空间学习能力检测表明，Wistar模型组学习记忆能力改变不明显，其潜伏期与对照组比较差异无显著性(图1a)。同时由图1可以看出，SD模型组大鼠的潜伏期与对照组比，出现稳定性的增加，在空间学习最后一天(第5天)束缚组的潜伏期与对照组比差异有显著性(P<0.05)。而两种品系大鼠水迷宫空间学习阶段的游泳速度与各自模型组比差异无显著性(图1 b)。

注：a.对潜伏期的影响，b.对游泳速度的影响。*表示与对照组比P<0.05(n=6，± s)。

2.4 水迷宫工作记忆实验结果

在工作记忆检测中，计算第2次训练潜伏期的平均值作为评价工作记忆能力指标[8,12]。由图2 a可知，每天束缚10 h，束缚28 d后，SD模型组寻台时间延长，潜伏期增加，与其相应对照组比差异有显著性(P<0.05)。而束缚应激对Wistar大鼠工作记忆能力影响不显著。由图2b 可知，工作记忆阶段，束缚应激对Wistar、SD两种大鼠游泳速度的影响不显著。

注：a.对潜伏期的影响，b.对游泳速度的影响。*表示与对照组比P<0.05(n=6，± s)。

3 讨论

SD和Wistar均属于远交系封闭群白色大鼠，是国际和国内临床前实验研究、学习记忆损伤机制研究以及相关防护药物筛选中常用的动物品系。束缚，是将动物置于无法逃脱的应激环境中，通过行为制动的方式，模拟人类社会中无法避免的拥挤、压力性空间等应激因素，造成动物心理应激的一种常用的造模方法。慢性束缚，是持续时间较长的一种造模方式，一般造模时间大于1 d[13]。更好的模拟了现代社会中，人们面临的压力持续时间增加的情况。本实验首次通过两种不同的认知行为学评价方法考察束缚应激对这两品系大鼠学习记忆能力的影响。

水迷宫定位航行实验是考察动物空间学习记忆能力的一种常用方法[8]。本实验的结果表明慢性束缚应激(10 h, 28 d)对SD大鼠空间学习记忆的损伤更明显(见图1)。这与两品系大鼠中枢神经系统中海马区神经元的数量及功能有关。应激特征性地对HPA轴(下丘脑-垂体-肾上腺轴)的激活，最终会导致糖皮质激素(大鼠主要为皮质酮，人主要为皮质醇)分泌的增加[14]。糖皮质激素在中枢系统中，主要通过海马神经元中丰富的糖皮质激素受体，影响与海马密切相关的空间学习记忆[15-16]。而SD大鼠较Wistar大鼠海马CA1区和CA3区含量更为丰富的锥体神经元细胞[17]，可能是应激引起SD大鼠神经元损伤强度和波及范围较广，进而导致空间学习记忆能力出现更为明显的损伤的重要原因。

新物体识别实验是评价动物识别记忆的简单、灵敏的方法[10]。本研究中，两品系模型大鼠在熟悉期表现出与各自对照组相同的探索能力，但是检测期的辨别指数与对照组比出现差异。这排除了探索行为的改变对认知检测结果的干扰，同时表明束缚应激对大鼠的识别记忆能力产生损伤，且对SD大鼠的损伤更明显(见表2)。

水迷宫工作记忆实验结果也表明，慢性束缚应激对SD大鼠的非空间学习记忆能力的损伤较Wistar大鼠更明显(见图2)。

结果表明，慢性束缚应激引起的外周作用在两品系大鼠中表现一致[18]。两种检测方法中，水迷宫对动物的体力要求较高，其具体体现在游泳速度上。而图1，2表明束缚应激在对速度的影响不显著的情况下，可引起空间学习能力、工作记忆的损伤。进而表明体重下降只是应激引起的外周作用的一种表现，与学习记忆能力并没有一定的相关性。

在慢性束缚应激模型建立过程中，根据所用束缚器的形状、规格不同，主要有以下的束缚方式[19]：(1)将动物置于圆形或锥形透明树脂束缚器内；(2)将动物固定于平板或衬垫上；(3)将动物裹在毛巾中；(4)将动物置于金属铁丝束缚器中，等。本研究所用方式在不影响动物生理代谢的情况下，尽量避免了对动物的物理性伤害，产生单纯由压力性空间所导致的心理应激模型。符合动物伦理的要求，同时满足了心理应激的造模条件。

同时，本实验通过2种行为学方法(物体认知、水迷宫)中的3种模式(新物体识别模式、空间记忆模式、工作记忆模式)，分别考察了所采用的慢性束缚应激(10 h，28 d)造模方式对Wistar、SD两品系大鼠空间、非空间学习记忆能力的影响。3种模式的实验结果均表明本研究采用的束缚应激方式可对大鼠认知能力产生损伤，且SD大鼠的损伤更明显。因此，本方法可作为束缚应激造模的一种方法，用以研究心理应激对学习记忆能力的影响。且本实验研究结果表明，在束缚应激所致认知损伤机制研究以及防护药物的筛选中，选用SD大鼠作为实验动物更为适宜。

[1] Bowman RE.Stress-induced changes in spatial memory are sexually differentiated and vary across the lifespan [J].J Neuroendocrinol.2005;17(8):526-535.

[2] Bergdahl J, Larsson A, Nilsson LG, et al.Treatment of chronic stress in employees: subjective, cognitive and neural correlates [J].Scand J Psychol, 2005, 46(5):395-402.

[3] Staufenbiel SM, Penninx BW, Spijker AT, et al.Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: a systematic review [J].Psychoneuroendocrinology, 2013, 38(8):1220-1235.

[4] McEwen BS, Morrison JH.The brain on stress: vulnerability and plasticity of the prefrontal cortex over the life course [J].Neuron.2013, 79(1):16-29.

[5] Jin LE.Reducing the harm of stress: medications to rescue the prefrontal cortex and overcome bad habits: the science of stress: focus on the brain, breaking bad habits, and chronic disease [J].Yale J Biol Med, 2011, 84(4):479-482.

[6] 何怡然, 马静遥, 陈铃铃, 等.DS-1226对慢性限制活动大鼠的抗抑郁作用 [J].中国实验动物学报, 2013, 21(3):42-47.

[7] Trofimiuk E, Walesiuk A, Braszko JJ.St John’s wort (Hypericum perforatum) diminishes cognitive impairment caused by the chronic restraint stress in rats [J].Pharmacol Res, 2005, 51(3):239-246.

[8] Vorhees CV, Williams MT.Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory [J].Nat Protoc, 2006, 1(2):848-858.

[9] 王琳, 田绍文, 黄伏连, 等.Neu-P11与褪黑素增强大鼠物体识别记忆 [J].中南医学科学杂志, 2012, 40(3):223-226.

[10] 宋广青, 孙秀萍, 刘新民.大鼠物体识别实验方法综述 [J].中国比较医学杂志, 2013, 23(7):55-60, 67.

[11] 宋广青, 高莉, 孙秀萍, 等.大鼠物体识别实验装置的研制 [J].中国比较医学杂志, 2013, 23(8):80-86.

[12] Liu P, Huang Z, Gu N.Exposure to silver nanoparticles does not affect cognitive outcome or hippocampal neurogenesis in adult mice [J].Ecotoxicol Environ Saf.2013, 87:124-130.

[13] 谢兴振,迟晓丽,周文霞,等.应激动物模型研究进展[J].中国新药杂志,2008,(16).

[14] Magarinos AM, McEwen BS.Stress-induced atrophy of apical dendrites of hippocampal CA3c neurons: involvement of glucocorticoid secretion and excitatory amino acid receptors [J].Neuroscience, 1995, 69:89-98.

[16] Conrad CD.What is the functional significance of chronic stress-induced CA3 dendritic retraction within the hippocampus? [J].Behav Cogn Neurosci Rev.2006, 5(1):41-60.

[17] Boss BD, Turlejski K, Stanfield BB, et al.On the numbers of neurons in fields CA1 and CA3 of the hippocampus of Sprague-Dawley and Wistar rats [J].Brain Res.1987, 406(1-2):280-287.

[18] 徐建芬.慢性束缚应激损害小鼠学习记忆和抑制体重增加 [J].浙江教育学院学报, 2004, (5):26-30.

[19] Buynitsky T, Mostofsky DI.Restraint stress in biobehavioral research: Recent developments.Neurosci Biobehav Rev.2009 Jul;33(7):1089-1098.