斑马鱼模型在中医药研究中的应用※

邢学锋 马钦海 徐成贺 许文学

（南方医科大学中医药学院中药药剂实验室，广州 510515）

近年来，随着中医药事业的迅猛发展，国内外对中药的研究也不断的深入。中药是多成分、多靶点的复杂体系，其药效物质是其发挥临床治疗作用的基础，中药药效筛选和评价的新技术和新方法的引进已成为中医药学者关注的重点。目前，模式生物斑马鱼的使用正逐渐拓展到生命体多个系统，并已应用于小分子化合物的大规模新药筛选。这对中药有效成分的筛选、作用机制的阐明、体内代谢的过程等具有巨大的促进作用。总结国内外研究发现，目前斑马鱼在中药中的应用主要集中在中药代谢研究、毒理研究和重大疾病中药成分活性筛选等几方面，本文将就斑马鱼在筛选模型、现代生物技术与传统中医中药研究相结合的新型模式等应用情况进行探讨，以期有益于中医药事业现代研究的发展。

1 斑马鱼的生物学特性

斑马鱼 (zebrafish)又名蓝条鱼、花条鱼，是辐鳍亚纲 (Actinopterygii)鲤科 (Cyprinidae)短担尼鱼属(Danio)的一种热带淡水鱼[1]。斑马鱼繁殖能力强，胚胎发育迅速，幼鱼体长非常小，作为药物筛选模型具有以下优点：筛选周期短、准确率高，胚胎透明、容易观察，样品用量少、用药简单、活体动物实验，与人类有高度相关性等优点，因而利用斑马鱼模型筛选出的成分其活性相对比较准确。

另外，此模型克服了只能观察化合物对某一特定生理过程的效果，无法从整体水平直观地评估药物的治疗作用、毒性作用、不良反应等体外细胞和化学筛选模型的缺点。活体动物的整体器官与表型筛选可观察化合物对复杂生命过程的影响[2]。

2 斑马鱼在中药毒理学方面的研究

从20世纪70年代末期，国外开始运用斑马鱼进行化合物的毒性、毒理研究[3]，斑马鱼现在已经被广泛地用于环境、药物、病理等毒理学领域的研究中，并显现出很多独特的优势[4]，目前其在药物早期毒性筛选方面最主要是运用在胚胎发育毒性、神经毒性、心脏毒性等方面的研究，且斑马鱼具有重复性好、预测性高等的体内筛选药物毒性的模式动物的独特优点，使其在新药研发方面具有重要价值，而在中药毒性筛选方面，主要集中在斑马鱼的胚胎、心脏的毒性影响的研究。

通过对研究不同中药，如飞机草[5]，雷公藤[6]，两面针[7-8]，莪术[9]、甘遂[10]秋水仙碱[11]等对斑马鱼胚胎心脏毒性、脑毒性等方面的影响，结果发现，不同的药物对其影响是不同的，且都呈现一定的毒性反应。

通过比较麻黄汤、小柴胡汤、葛根芩连汤这三个经典方剂的超微饮片与传统饮片水煎液对斑马鱼胚胎毒性的影响时，发现超微中药饮片毒性大于传统中药饮片，为超微饮片临床用药安全性提供实验依据[12]。

Pyun等[13]通过绿茶中微量成分表儿茶精对斑马鱼因抑制活性氧防止辐射诱发听细胞死亡作用的研究。结果表明：表儿茶精对辐射诱发的胚胎毒性有明显减弱作用，并能防止辐射诱发的神经丘毛细胞减少，将其作为防治辐射诱发耳毒性的安全有效候选药物。

通过以上在中药毒性的胚胎、心脏毒性的研究中对斑马鱼模型的应用和前人通过斑马鱼模型对药物毒性筛选的研究，充分显示了斑马鱼模型在其他毒性方面的运用也有很大的空间，如心血管毒性、行为毒性等方面，但是运用斑马鱼对中药毒性研究报道还很少。另外，由于斑马鱼与人和其他的哺乳动物存在一定的差异，且中药是一个复杂的、多靶点的体系，与化学药物单一成分的研究有很大的不同，所以运用斑马鱼模型在其他方面的毒性中药的筛选的可靠性和适用性都还需要进一步的研究评价。

3 斑马鱼在中药活性筛选和评价中的应用

随着高通量筛选技术的发展，虽然可以通过体外筛选来获得包括中药成分在内的大量活性化合物，但由于很多中药成分的复杂性，往往存在吸收、分布、代谢、排泄及毒性等方面的问题。所以，对这些活性化合物进行动物实验鉴定非常必要。目前，用于药物筛选的动物模型有很多，但存在各种不足因素，而由于斑马鱼的基因、遗传等方面有高度的相似性，在药物筛选方面具有巨大的潜能。利用基因突变的方法，建立各种斑马鱼疾病模型[14]，产生与斑马鱼突变系具有与人类疾病相似的症状，这对新药筛选和内脏特异性毒理学研究起着至关重要的作用。

3.1 斑马鱼模型在中药调节血管新生研究中的应用 在许多疾病的发生发展过程中，伴随着机体对血管新生的调控失衡，特别是在肿瘤、风湿性关节炎等疾病的影响尤为突出。由于斑马鱼的胚胎发育透明，早期血管生成模式较简单等特点和中药本身的特点，斑马鱼整体器官模型在血管新生药物的筛选方面起到重要的作用，更加适合于中药活性成分的筛选[15]。

ZhaoH等人[16]利用斑马鱼的血管损伤模型发现当归提取物水溶性成分SBD-4，能有效的复原斑马鱼的血管。此次发现也说明了通过转基因斑马鱼筛选而发现的具有促血管新生活性的当归提取物可作为治疗血管新生不足类疾病潜在的药物而改善人类的生活。

通过对地黄水提取物的不同溶剂萃取部位进行了活性筛选，采用转基因斑马鱼 [TG (fli1：EGFP)y1/+(AB)]胚胎血管生成模型，并对活性部位主要化学成分进行了血管药效学研究。发现地黄水粗提取物可增加斑马鱼肠下静脉毛细血管形成数量，且有促进血管生成的作用[17]。

3.2 斑马鱼模型在中药对神经系统方面的应用 具有神经活性的小分子是治疗精神类疾病的主要药物来源，但这类药物存在较难发现与鉴定等方面的难题。而利用斑马鱼可有效筛选影响生物体复杂功能行为并治疗神经系统疾病的药物。目前，在运用斑马鱼于中药对神经系统方面的研究主要集中在对学习记忆、血脑屏障和一些相关性疾病方面的研究。

3.2 .1 斑马鱼在学习与记忆研究中的应用 在学习与记忆研究中，斑马鱼具有两个突出的优点，一是利用斑马鱼幼鱼的透光性，运用注射荧光染料或者转基因的方法，我们可以通过成像实时观察神经系统的活动。其二是可以记录清醒斑马鱼上的在体电生理神经元的电活动。

通过对东莨菪碱致记忆障碍斑马鱼模型的防治作用的中药研究，发现槲皮素和芦丁药物都可预防由东莨菪碱导致的记忆障碍，而且不影响鱼体的正常运动，并提出槲皮素和芦丁等药物成分可以作为神经系统疾病 (如阿尔茨海默症)的治疗药物[18]。

通过对一些中药进行斑马鱼免疫染色和行为学试验筛选，Zhang ZJ等人[19-20]筛选到益智仁提取物 (AOE)和谷精草提取物 (EB)的神经保护作用。AOE乙醇提取物可以预防和恢复6-OHDA诱导的多巴胺神经元退化，对斑马鱼的游泳行为缺陷具有改善作用。EB可以恢复多巴胺神经元的损伤，延长6-OHDA模型斑马鱼的运动距离，发挥神经保护作用，并剂量依赖性作用。

3.2 .2 斑马鱼在一些神经疾病方面的研究 利用斑马鱼药物依赖模型对钩藤提取物进行研究，结果表明钩藤提取物对甲基苯丙胺等神经依赖性药物具有治疗干预作用[21]。根据斑马鱼的生理学特性和现在对抗焦虑模型的对比，方芳[22]等提出运用新鱼缸潜水实验和报警信息素两种途径建造模型来筛选中药的抗焦虑疗效，并提出了其优越性，为筛选抗焦虑中药提供了依据。此外，斑马鱼模型在中药治疗忧郁症、睡眠紊乱等神经系统疾病的筛选也有相关的研究。

3.3 斑马鱼在抗骨质硫松中药活性成分筛选的应用由于斑马鱼和人类在骨骼发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，而且其幼鱼透明的身体使得能在活体的状况下对斑马鱼体内的骨架形成及发育进行观察，并可以使用染料对骨架进行染色，能进一步对骨骼的大小和骨密度进行定量化。而由于斑马鱼的生理特性和中药的多成分、多靶点的特点，采用斑马鱼建立壮骨效应评价新模型，有望成为体现中药整体观的，兼具体优势、灵敏、高效地评价中药抗骨质疏松效应的目标。

王娟[23]等研究淫羊藿苷对牙齿钙磷沉积的影响，结果表明淫羊藿苷对牙齿发育中的钙磷沉积有一定的影响，这对于在临床上龋病的防治有良好的指导意义。为进一步明确将斑马鱼作为牙齿发生发育分子生物学研究模型的可行性和先进性；研究牙齿发育的重要信号因子 （Pax9基因、Pitx2基因）在牙发生发育过程中的作用机制及作用途径和淫羊藿苷对牙齿生长发育的影响，李瑾等[24]对斑马鱼的组织结构和超微结构及斑马鱼背腹轴形成和骨化相关基因的研究。

3.4 斑马鱼在中医针灸经络研究中的应用 在中医研究中，经络和穴位的研究一直是个难点，也是众多中医药研究者研究的热点，穴位主要功能是感觉，针刺穴位所产生的酸麻胀痛热等针效均表现为感觉器官的反应。有研究发现，感觉器官在躯体的有规律的集中分布在功能上类似于穴位。中医对经络的经典描述与研究所观察到的感觉器官所形成的线类似，都形成若干条线。因此，有研究者推测斑马鱼存在类穴位与类经络结构；斑马鱼皮肤感觉器官并不是均匀地分布于全身，而是若干感觉器官聚集在一起形成有规律的簇，而若干簇又有规律地沿躯体长轴排成线，类似于传统经络与穴位[25]。这一研究对中医的经络学说的继续发展具有有力的推动作用，并对中药与针灸学相结合的穴位给药提供了强有力的实验模型。

4 斑马鱼模型在中药药物代谢研究中的应用

近年来，对中药药物代谢的研究主要借助于化学药物代谢的基本理论和方法，通过对药物在体内吸收、分布、代谢等过程的变化，并用动力学原理阐明动态变化的规律。斑马鱼作为研究体内药物代谢的平台已逐渐引起中医药学者关注。

Li ZH等[26]首次利用蛋白质组学以及转录组学的方法检测到斑马鱼与哺乳动物的代谢酶体系极度相似性，从而构建了斑马鱼研究中药及其单体药物代谢的平台。他们还用多种方法：包括蛋白组学等研究手段，对淫羊藿黄酮类化合物如淫羊藿素、淫羊藿苷和朝藿定C在斑马鱼体内分布和代谢机制进行研究。结果阐述了淫羊藿黄素及其衍生物在斑马鱼整体模型中的代谢途径、分布机制，为斑马鱼成为一种实用的体内代谢筛选模型提供了理论依据[27]。Hu G等人[28]通过LC-MS/MS方法，鉴定分析毛蕊异黄酮在斑马鱼幼鱼中吸收和代谢的产物，表明毛蕊异黄酮可能的代谢途径有葡萄糖醛酸化、糖基化、硫酸化、氧化或上述两种代谢过程。

5 展望

斑马鱼由于其发育快、胚胎期透明以及可用于大批量的快速筛选等诸多优点，已经被广泛用于胚胎分子发育与疾病模型的构建，以及药物筛选等研究的模式生物，且逐渐成为开展中医药研究的一个重要的体内模型。目前斑马鱼应用于中医药的研究还处于探索阶段，并主要集中在中药成分组分的研究应用、药效成分的筛选上。但根据已取得研究结果可以肯定，斑马鱼在解决中药复方研究中的几个关键问题——是否有效、为什么有效、什么成分有效上均可发挥重要作用。因此，结合传统中医药理论、临床实践及现代研究进展，应用斑马鱼生物模式开展药效学、药物代谢学及毒理学等全方面多角度的中药研究前景较为理想。随着斑马鱼转基因模型的发展以及更多的斑马鱼疾病模型的建立，将会为今后中医药国际化提供更多全面而又便利的科研平台和更为科学的理论依据，也将为中医药现代化的进程提供新兴的动力。

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