快速敲除补回家蚕核型多角体病毒ORF29

王 蓉

（浙江理工大学，浙江杭州 310018）

快速敲除补回家蚕核型多角体病毒ORF29

王 蓉

（浙江理工大学，浙江杭州 310018）

利用Red重组系统成功敲除家蚕核型多角体病毒ORF29基因（BmNPV ORF29，简称Bm29），并利用Bac-to-Bac系统构建补回型的Bm29基因。通过PCR鉴定敲除和补回均成功，为后续的Bm29基因功能研究奠定基础。

家蚕核型多角体病毒；ORF29基因；Red重组；Bac-to-Bac

杆状病毒是已知昆虫病毒中类群最大，且具有较大实用意义的昆虫病毒［1］。目前，已有29种昆虫杆状病毒的基因组被完全测序［2］。

基因敲除技术是研究基因功能的一种常用手段。传统的构建重组杆状病毒方法是利用转移载体与野生型病毒DNA共转染昆虫细胞，通过同源交换和空斑纯化获得重组病毒，但该方法不仅重组效率低，而且耗时耗材［3］。近年来，Red重组系统，因其准确率高、操作简便的优点逐渐成为新型的基因敲除方法［4］。Red重组系统属于λ噬菌体的重组系统，它的编码基因exo，bet和gam置于L-阿拉伯糖启动子控制下，在L-阿拉伯糖诱导下能够表达重组所需的酶，从而介导线性化片段与染色体的特定片段进行同源重组，进而利用外源基因替换靶基因［5］。目前，已经有报道利用Red重组成功敲除了杆状病毒基因lef-6，l ef-8和lef-10［6-8］。

家蚕核型多角体病毒（BmNPV）基因组已经被测序完全，含有136个完整的开放阅读框［9］。BmNPVORF29，简称Bm29，全长654 bp，位于BmNPV基因组T3株的26449～27102 bp处，表达产物预测分子量为22.0 ku。该基因功能的研究还一直未见报道，本文首次利用Red重组系统在大肠杆菌中成功地对Bm29基因进行了定点敲除，并利用Bac-to-Bac系统补回缺失型的Bm29基因，为后续基因功能的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

BW 25113-Bac、E.coli TG1和DH10Bac菌种，质粒pFastBac1、pKD3和pKD46均由本实验室保存。

Taq酶、限制性内切酶Eco RⅠ和Bam HⅠ，T4 Ligation，DL2000，1 kb DNA Marker购于TaKaRa公司；L-阿拉伯糖购自美国Promega公司；凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物合成、测序由Invitrogen公司完成；其余试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 Bm29基因的敲除型的构建

PCR制备Bm29基因打靶线性化片段。以pKD3质粒为模板，引物由50 bp的Bm29基因的同源臂（下划线为同源臂）和20 bp的cat的同源区组成，如下：Bm29-C-F3'）。PCR扩增获得1 100 bp左右的打靶片段，命名为Bm29-C。

将纯化后的Bm29-C转化至DH10Bac感受态细胞（含pKD46质粒）中，加入L-阿拉伯糖的诱导表达λRed，使得Bm29-C与病毒基因组中的Bm29基因发生同源重组。进行蓝白斑筛选，并做PCR、双酶切鉴定和测序（图1）。

为了验证Bm29基因是否被敲除，用不同的引物组合进行PCR鉴定。所用的验证引物分别为Bm29-F（5'-CGCTGCAGGATTGTTTATGA-3'）和Bm29-R（5'-TTACACCCGCCTAAGTGCGTGC-3'）、Bm29-F和cat-R（5'-CAATATGGACAACTTCTTCG-3'）、cat-F（5'-CAATATGGACAACTTCTTCG-3'）和Bm29-R。

图1 Bm29基因敲除型构建策略

1.2.2 Bm29基因的补回型的构建

将Bm29基因补回至Bm29-KO-Bacmid中，需构建重组质粒pFastBac1-Bm29，并利用Bac-to-Bac系统将Bm29基因异位补回到多角体启动子下（图2）。

图2 Bm29基因补回型构建策略

根据Bm29基因的序列并在上下游插入酶切位点Eco RⅠ和Bam HⅠ，来设计引物。引物分别pFB-Bm29-R线为酶切位点Eco RⅠ）及pFB-Bm29-F（5'-为酶切位点Bam HⅠ）。以wtBacmid为模板，pFBBm29-F和pFB-Bm29-R为引物进行PCR扩增。纯化后的PCR产物与载体pFastBac 1分别用EcoRⅠ和Bam HⅠ进行双酶切。连接产物，并进行蓝白斑筛选。对重组质粒pFastBac1-Bm29进行双酶切和PCR鉴定，并测序。将重组成功的质粒转化至DH10Bac感受态细胞（Bm29缺失型病毒）中，Bm29基因重新补回Bm29-KO-Bacmid中，获得补回型Bm29-Re-Bacmid。

为了鉴定是否成功补回，利用M13和Bm29基因特异性引物对Bm29-KO-Bacmid和Bm29-Re-Bacmid进行PCR，引物组合分别为M13-F（5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'）和M13-R（5'-CAGGAAA CAGCTATGAC-3'）、M13-F和pFB-Bm29-R、PFBBM29-F和M13-R。

2 结果与分析

2.1 鉴定Bm29基因的敲除

PCR鉴定Bm29基因是否敲除成功，结果如图3。结果显示Bm29-F和Bm29-R为引物的扩增产物大小约为1 600 bp；Bm29-F和cat-R为引物的扩增产物大小约为460 bp；cat-F和Bm29-R为引物的扩增产物大小约为1 100 bp；以上结果表明已成功将Bm29基因从Bcmid基因组中敲除。

图3 敲除Bm29的PCR鉴定

2.2 鉴定Bm29基因的补回

图4 补回型Bm29的PCR鉴定

PCR鉴定Bm29基因是否正确补回。结果如图4。以M13-F和M13-R为引物的扩增产物大小约为2 300 bp；以M13-F和pFB-Bm29-R为引物的扩增产物大小约为3 000 bp；以pFB-Bm29-F和M13-R为引物的扩增产物大小约1 360 bp，均与理论值相符。表明Bm29基因已成功补回。

3 小结和讨论

研究杆状病毒基因的功能需要将目的基因失活，利用Red重组系统［10-14］只要50 bp左右的同源臂即可介导外源基因与目的基因发生同源重组。这种方法不需要体外酶切反应，也不存在其他碱基突变的危险，是一个简单、快速、高效的基因敲除系统［15］。

本文利用Bac-to-Bac系统构建补回型病毒，通过PCR鉴定敲除和补回型的Bm29基因，为后续的基因功能研究奠定基础。

［1］ 郭忠建，姚勤，王海燕，等.利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒orf60基因［J］.生物工程学报，2007，23（5）：801-805.

［2］ Jehle JA，Blissard G，Bonning B，et al.On the classification and nomenclature of baculoviruses：a proposal for revision［J］. Archives of Virology，2006，151（7）：1257-1266.

［3］ O'Reilly D R，M iller L K，Luckow V A.Baculovirus expression vectors：a laboratory manual［M］.New York：Oxford University Press，1994.

［4］ 张雪，温廷益.Red重组系统用于大肠杆菌基因修饰研究进展［J］.中国生物工程杂志，2008，28（12）：89-93.

［5］ 李樊，刘义，何钢.基因敲除技术研究进展［J］.生物技术通报，2008（2）：80-82.

［6］ Lin G，Blissard G W.Analysis of an Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus lef-6-null virus：LEF-6 is not essen tial for viral replication bu t appears to accelerate late gene transcription［J］.Journal of Virology，2002，76（11）：5503-5514.

［7］ Acharya A，Gopinathan K P.Characterization of late gene expression factors lef-9 and lef-8 from Bombyx mori nucleopolyhedrovirus［J］.Journal of General Virology，2002，83（8）：2015-2023.

［8］ Yu W，Du C Y，Quan Y P，et al.Characterization of late gene expression factor LEF-10 from Bombyx mori nucleopolyhedrovirus［J］.Virus Research，2013，175（1）：45-51.

［9］ Gomi S，Majima K，Maeda S.Sequence analysis of the genome of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus［J］.Journal of General Virology，1999，80（5）：1323-1337.

［10］ Passarelli A L，Guarino L A.Baculovirus late and very late gene regulation［J］.Current Drug Targets，2007，8（10）：1103-1115.

［11］ Gomi S，Majima K，Maeda S.Sequence analysis of the genome of Bombyxmori nucleopolyhedrovirus［J］.Journal of General Virology，1999，80（5）：1323-1337.

［12］ Vanarsdall A L，Okano K，Rohrmann G F.Characterization of the replication of a baculovirus mutant lacking the DNA polymerase gene［J］.Virology，2005，331（1）：175-180.

［13］ Vanarsdall A L，Okano K，Rohrmann G F.Characterization of a baculoviruswith a deletion of vlf-1［J］.Virology，2004，326（1）：191-201.

［14］ Datsenko K A，Wanner B L.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，2000，97（12）：6640-6645.

［15］ 王军平，张友明.Red/ET重组及其在生物医学中的应用［J］.生物工程学报，2005，21（3）：502-506.

（责任编辑：张 韵）

S 884.5

：A

：0528-9017（2014）10-1624-03

文献著录格式：王蓉.快速敲除补回家蚕核型多角体病毒ORF29［J］.浙江农业科学，2014（10）：1624-1626.

2014-08-21

王 蓉（1989-），女，安徽当涂人，硕士研究生，主要从事基因表达与调控研究工作。E-mail：wangrong_8912 @163.com。