Osterix在调控脊椎松质骨骨量中的作用*

宗兆文,陈思旭,贾 敏,华 祥,郭庆山,沈 岳,赵玉峰,刘道城,Jerry Feng

(1.第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤/烧伤与复合伤国家重点实验室创伤科，重庆 400042；2.德克萨斯州卫生科学中心Baylor医学院生物医学系，美国德克萨斯州达拉斯75246)

骨质疏松是一种以骨量低下、骨微结构破坏为特点，进而导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病[1]。骨质疏松不仅威胁中老年人的健康，也给家庭和社会带来的沉重的经济负担。骨质疏松被认为是一个多因素疾病，但其具体发病机制尚不明了，导致其防治效果不佳[2-3]。Osterix是重要的成骨相关转录因子，被证实在成骨细胞的成熟和向骨细胞的终末分化中起到重要作用[4-6]。本研究通过转基因和基因敲除的方法观察Osterix在调控脊椎骨量中的作用，并探索其可能机制，以期为探索骨质疏松的发病机制提供一定线索。

1 材料与方法

1.1材料 Osterix Lox P +/+ 小鼠、2.3 kb Collagen Ⅰ Cre小鼠和3.6- kb Cre Osterix 转基因小鼠由美国德克萨斯州卫生科学中心 Baylor医学院Jerry Feng教授馈赠。Osterix Lox P +/+小鼠和2.3 kb Collagen Ⅰ Cre小鼠杂交以获得Osterix Lox P +/+;2.3 kb Collagen Ⅰ Cre小鼠进而敲除Osterix。

1.2方法

1.2.1常规PCR进行基因型鉴定 取新生9 d小鼠适量尾巴，常规方法提取基因组DNA，然后取1 μg提取的DNA常规PCR进行基因型鉴定。Osterix敲除小鼠使用的引物为：5′-CTT GGG AAC ACT GAA GCT GT-3′和 5′-CTG TCT TCA CCT CAA TTC TAT T-3′；Osterix转基因小鼠使用的引物为：5′-GAA GCG ACC ACT TGA GCA AAC AT-3′和5′- TGT CCA AAC TCA TCA ATG TAT CT-3′。

1.2.2X线片检查 出生后12周，戊巴比妥那过量麻醉致死野生型小鼠、Osterix 转基因小鼠和Osterix敲除小鼠(n=4)，取腰段脊柱，4%多聚甲醛4 ℃过夜固定，次日剔除脊柱周围软组织，拍摄脊柱X线片。

1.2.3显微电子计算机X线断层摄影术(micro-computerized tomography,Micro-CT)检测 取上述小鼠第5腰椎，采用Micro-CT机(Scanco Medical,Bassersdorf,Switzerland)进行常规扫描，计算其骨量与脊椎总体积的比值(bone volume / total volume,BV/TV)。

1.2.4组织学处理 取上述标本中的第5腰椎10%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙后，制备石蜡切片。冠状面5 μm切片，常规脱蜡和梯度乙醇水化切片备用。

1.2.5苏木素-伊红(HE)染色 5 μm组织切片常规进行HE染色。方法简述如下：取1.3中准备好的切片苏木素染色5 min，自来水冲洗1～3 s后1%盐酸乙醇分色1～3 s。蒸馏水过洗 1～2 s后0.5%伊红染色 1 min，蒸馏水稍洗 1～2 s后梯度乙醇脱水、二甲苯透明后中性树胶封固切片。

1.2.6抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色 预热两个装有50 mL基础孵育液的玻璃染色缸至37 ℃，然后在其中一个加入50 μL 2% 磷酸萘酚，加入1.2.3处理好的片子，37 ℃孵育45 min。然后将1 mL 5%副品红和 1 mL 4%亚硝酸钠混匀后加入另一个染色缸，将切片转移到第二个染色缸，染色约2 min。蒸馏水漂洗后用甲基绿对抗染色，然后常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明后中性树胶封固切片。其中基础孵育液配制方法为将9.2 g无水醋酸钠、11.4 g无水酒石酸钠和2.8 mL冰醋酸加入蒸馏水，并定容为1 000 mL，并调节pH值为4.7～5.0。

1.2.7免疫组织化学染色 取1.2.3中准备好的切片，3%H2O2封闭切片用1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)充分漂洗后加非特异性封闭血清室温封闭1 h后加羊抗兔RANKL一抗，4 ℃孵育过夜。次日PBS漂洗3次后加入相生物素化小鼠抗养二抗，室温孵育1 h。PBS充分漂洗后DAB显色，适度显色后蒸馏水终止反应然后用甲基绿对抗染色。

2 结 果

2.1Osterix敲除小鼠骨量增加 Mico-CT结果显示，Osterix转基因小鼠中的骨小梁数量同野生型小鼠之间无明显差异，而Osterix敲除小鼠第5腰椎中骨量大量增加，明显高于野生型小鼠，差异有统计学意义(P<0.01),见图1。

A：野生型小鼠第5腰椎；B：Osterix转基因小鼠腰椎；C：Osterix敲除小鼠腰椎；D：3种小鼠中骨量定量分析结果。

图1 Micro-CT检测3种小鼠脊椎中骨量的差别。

A：Osterix敲除小鼠(左)和野生型小鼠(右)的X线片；B:Osterix敲除小鼠的HE染色；C：野生型小鼠的HE染色；D：Osterix敲除小鼠的TRAP染色；E：野生型小鼠的TRAP染色；F：Osterix敲除小鼠的RANKL免疫组织化学染色；G：野生型小鼠的RANKL免疫组织化学染色。

图2 Osterix敲除小鼠的特征

A：Osterix转基因小鼠(左)和野生型小鼠(右)的X线片；B:Osterix转基因小鼠的HE染色；C：野生型小鼠的HE染色；D：Osterix转基因小鼠的TRAP染色；E：野生型小鼠的TRAP染色。

图3 Osterix过表达转基因小鼠的特征

2.2Osterix敲除小鼠破骨细胞数量减少 X线片检测显示在出生后12周，Osterix敲除小鼠脊椎骨密度增加，HE检测显示其椎体中骨量增加。采用TRAP染色检测了Osterix敲除小鼠脊椎中破骨细胞的数量，结果发现Osterix敲除小鼠脊椎中破骨细胞的数量和染色强度明显低于野生型小鼠。免疫组织化学染色结果显示，Osterix敲除小鼠脊椎中RNAKL表达水平低于野生型小鼠，见图2。

2.3Osterix过表达转基因小鼠骨量无显著变化 而在Osterix转基因小鼠中，脊椎X线片显示其密度和HE染色显示其骨量同野生型小鼠无显著差异。同时，TRAP染色和免疫组织化学检测显示Osterix转基因小鼠脊椎中破骨细胞数量和RNAKL表达水平同野生型小鼠无显著性差异，见图3。

3 讨 论

随着世界人口日趋老龄化，骨质疏松的发病率越来越高，对中老年人的身体健康构成严重的威胁。骨质疏松治疗主要的目的是提高骨强度以减少骨折的发生率[7]。骨强度由多种因素决定，其中骨量是重要因素之一[8-10]。参与骨量调节的因素和信号转导通路有多种，但尚不确定哪种因素或哪条信号通路起到重要作用[3,11-14]。

Osterix是成骨过程中重要的转录因子。胚胎期敲除Osterix导致小鼠完全没有骨性成分形成，出生后敲除Osterix后小鼠的成骨细胞成熟和向骨细胞分化严重受阻[4-6]。这些结果提示，Osterix无论在胚胎期还是出生后的骨发育和骨成熟中起到重要作用。鉴于Osterix在成骨中的重要作用，笔者通过基因敲除和转基因小鼠观察了其在调控腰椎骨量中的作用。本研究发现，Osterix过表达的转基因小鼠骨量无明显变化，而Osterix敲除小鼠腰椎骨量明显增加，提示Osterix在调控小鼠腰椎骨量中起到不可或缺的重要作用。

由于成骨和破骨之间的平衡决定最终的骨量的多少，而有研究已经证实Osterix敲除小鼠的成骨能力明显低于野生型小鼠[4-6]。因此，笔者进一步观察了Osterix敲除小鼠的破骨细胞的活性和数量变化情况，TRAP染色结果显示，Osterix敲除小鼠脊椎中破骨细胞数量明显下降。因而在Osterix敲除小鼠中，其成骨和破骨能力均下降，但后者下降的更明显，导致总的效应为骨量增加。

在破骨细胞成熟的过程中，成骨细胞等分泌RANKL调节其成熟[15-17]。本研究发现，Osterix敲除小鼠脊柱中RANKL的表达水平明显下调，这是导致破骨细胞的数量明显降低的原因。而破骨细胞数量的减少，导致成骨与破骨之间的平衡被打破，引起Osterix敲除小鼠脊椎中骨量增加。

综上所述，Osterix在调控脊椎骨量中起到重要作用，其主要的作用机制是通过调节成骨和破骨细胞之间的平衡得以实现。而Osterix在调节脊椎骨量的过程中与其他信号通路之间的相互作用关系需要进一步观察，以更好为治疗骨质疏松提供好的线索。

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