蛇毒鉴定的研究进展

张经硕，向 平，沈 敏

（1.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海200063；2.苏州大学医学部，江苏苏州215123）

1 概述

毒蛇咬伤常见于热带和亚热带地区。在非洲、亚洲、大洋洲和拉丁美洲的农村地区，毒蛇咬伤是特别突出的公共卫生问题[1-2]。最近的一项研究估计：全球范围内，每年遭受毒蛇咬伤超过50 000 000人，导致死亡25 000～125 000人[2]。我国蛇伤发病主要在南方各省[3]，以夏秋季多见。据报道我国每年被毒蛇咬伤超过100 000人，其中有将近10 000人会死亡[4]。近年来，由于环境改变、饲养蛇、野外作业等多种因素，蛇伤发病还呈现出逐年增多的趋势。

在法医工作中，怀疑是蛇毒中毒的案件经常发生，确定是否是蛇毒中毒，是哪种蛇毒中毒，是解决该类案件的关键。目前，我国的蛇伤鉴定方法主要是依靠观察牙痕、症状和生化常规检查，其中牙痕是关键。但是，在实际工作中又经常会碰到没有明显牙痕的案件，这时就得凭经验通过症状和生化指标来判断是否是蛇毒中毒、是哪种蛇毒中毒，错误判断的可能性非常大，因此，我们亟需新的鉴定技术。为此，笔者收集了国内外已报道的蛇毒鉴定技术和蛇毒中毒生物标记物的研究方法，详细分析了这些方法的优缺点，以期找到更为准确可靠的蛇毒中毒鉴定新方法。现将国内外的相关研究进展综述如下。

2 蛇毒的种类

蛇毒是复杂的混合物，其毒性成分主要是具有酶活性的蛋白质和多肽。蛇毒对机体的作用很复杂，按其有毒成分的毒理作用可分为神经毒、血液毒和混合毒，按其作用性质不同又可分为神经毒素、心脏毒素、溶血毒素、凝血毒素和抗凝血毒素[5]。

蛇毒是蛇类用于捕食和消化的工具，不同种类的蛇毒其所含的蛋白质和多肽是不同的[6]，这为鉴定是否为蛇毒中毒以及区分不同的蛇毒中毒提供了可能性。

3 蛇毒中毒的毒理机制

3.1 神经毒素作用机制

蛇毒神经毒素主要是β-神经毒素和α-神经毒素，分别作用于神经突触和终板。β-神经毒素可以抑制乙酰胆碱释放，而α-神经毒素可以竞争结合乙酰胆碱受体，两种毒素均可以通过阻滞神经信号的正常传导而引起肌肉麻痹的症状[7]。早期表现为眼睑下垂、吞咽困难，进而呼吸肌麻痹导致呼吸衰竭，甚至呼吸停止。

3.2 心脏毒素作用机制

心脏毒素又称为细胞毒素，其可以引起细胞膜通透性改变和组织坏死，轻者引起肢体肿胀和皮肤坏死，重者可导致局部组织大面积深度坏死，导致患肢残废，甚至还可以使心肌细胞坏死从而造成心肌损坏[8]。

3.3 溶血毒素作用机制

蛇毒中有溶血作用的毒素主要是磷脂酶A2，其作用底物为Sn-3-磷酸甘油酯第二位酯键，当其作用于血清或卵磷脂时产生溶血卵磷脂，导致红细胞溶血。磷脂酶A2也可直接作用于红细胞膜上的磷脂，引起直接溶血[9]。

3.4 凝血毒素作用机制

凝血毒素是蛇毒中存在的一类能作用于血液凝固酶促级联反应过程中一个或多个环节的蛋白质，可以激活凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅸ、凝血因子Ⅹ、凝血因子Ⅱ或直接使纤维蛋白原凝集[10]。

3.5 抗凝血毒素作用机制

蛇毒中的抗凝血毒素主要是类凝血酶和纤溶酶[11]。蛇毒类凝血酶在体内可以消耗纤维蛋白原，造成纤维蛋白原缺乏而产生抗凝血作用。蛇毒纤溶酶在体内可以降解纤维蛋白和纤维蛋白原，还可以水解和灭活凝血酶原、凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅻ，从而产生抗凝血作用。

4 鉴定方法

自20世纪70年代起，医学界涌现了大量研究蛇毒和蛇伤鉴定的新技术。从早期的凝集测试法、免疫电泳法、放射免疫法和酶联免疫吸附法，到近期的聚合酶链反应、荧光免疫法、光学免疫法、生物传感器、基质辅助激光解析离子化质谱和电喷雾离子化质谱，众多新技术的出现，使得通过伤者体内蛇毒检测进行蛇伤法医鉴定具备了可行性。

蛇毒中的毒素蛋白质进入伤者体内后会迅速被体液稀释，并扩散至全身多个组织，与伤者的内源物质混存，这一方面导致体内毒素蛋白质的浓度极低，另一方面也导致体内蛇毒的鉴定极易被内源物质干扰，因此，鉴定方法的灵敏度和抗干扰能力至关重要。经各国学者研究，一些新技术在体内蛇毒鉴定方面表现出了优异的性能，其检测灵敏度和排除生物样品中内源物质干扰的能力非常突出，已经可以尝试应用于临床蛇伤的鉴定；但是，也有一些方法经研究发现其检测灵敏度和抗干扰能力不足，暂时还只能用于纯蛇毒的鉴定。

4.1 聚合酶链反应法（polymerasechain reaction，PCR）

PCR是一种用于体外放大和扩增特定DNA片段和RNA片段的技术，类似于DNA的体内复制。首先将待扩增的DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下这种循环的不断重复。

2001年，Suntrarachun等[12]首次采用PCR方法鉴定蛇伤，试图区别孟加拉眼镜蛇咬伤与当地的其它蛇类咬伤（眼镜王蛇、金环蛇、圆斑蝰蛇和红口腹蛇）。他们选择了眼镜蛇毒素（Cobrotoxin）作为引物，将蛇伤小鼠伤口清洗液中的DNA和RNA扩增后用于对蛇种的鉴定。Suntrarachun确实检测到了一段眼镜蛇毒素编码基因中的cDNA片段，并且该cDNA片段的特异性还不错（在当地其它蛇毒中检测不到），但是考虑到蛇咬的伤口通常比较小，并且也不会总是残留足够的毒腺上皮细胞（这将导致鉴定结果的准确性较差），所以Suntrarachun并没有将该方法应用于人类伤者身上。

PCR技术是一种非常成熟的扩增基因的方法，Suntrarachun创造性的将其应用于生物样品中蛇毒的鉴定研究，这为蛇伤鉴定指出了一条新思路。虽然鉴于鉴定结果的准确性问题，Suntrarachun并没有将这一技术完善成可供实际蛇伤案件使用的方法，但是在个别案件中还是可以考虑尝试一用。

4.2 凝集测试法（agglulinalion assay）

凝集试验是一种免疫学检测方法，需要将抗原与含有相应抗体的血清混合，使二者发生特异性结合形成抗原抗体复合物，在一定浓度的电解质作用下，复合物表面的电荷大部分被消除而失去了互相排斥的作用，于是复合物之间互相吸引凝集成团，出现肉眼可见的凝集现象。

1991年，Chinonavanig等[13]以凝集测试技术为基础开发了一种反向乳胶凝集方法用于检测蛇毒。Chinonavanig获得的体外测试结果显示，该方法检测蛇毒的检测限高达0.16～1.2μg/mL，而且由于该方法使用的抗体是兔抗蛇毒血清，所以在异源蛇毒间存在明显的交叉反应。在进一步的临床测试中，Chinonavanig又检测了59份血清样本和26份伤口拭子，结果显示该方法对血清蛇毒的检出率很低，仅仅只有52.5%，而且还有1例假阳性结果；对伤口拭子上蛇毒的检出率更低，只有38.5%。虽然Chinonavanig的尝试没有获得理想的结果，但是他奠定了凝集测试技术鉴定蛇毒的基础。1993年，Kittigul等[14]进一步完善了这种技术，Kittigul用兔抗蛇毒血清活化的羊、鸡和人的红细胞作为检测试剂，使用反向被动血凝法对泰国6种毒蛇的蛇毒进行了检测，结果显示该方法的检测浓度下降到了2～635ng/mL，但在不同蛇毒间还是存在明显的交叉反应。在检测血清样本时，Kittigul的检测方法达到了81.3%的正确检出率，但是在检测伤口拭子样本时，Kittigul的检测方法却只获得了61.5%的正确检出率。Kittigul的蛇毒鉴定方法在检测浓度和正确检测率这2项指标上相比于Chinonavanig的方法有了很大的提高，但是却仍然存在正确检出率偏低（81.3%）和交叉反应明显的问题。1997年，哥斯达黎加的Amuy等[15]继续对蛇毒凝集测试技术做出改进，他们尝试用亲和纯化抗体来构建黑纹珊瑚蛇（Micrurus nigrocinctus）蛇毒的乳胶反向凝集方法，希望能够实现蛇毒的种属特异性鉴定，但是Amuy的方法在测试阶段仍然对同属的其他6种蛇毒显示出了明显的交叉反应。

凝集测试法应用于体内蛇毒鉴定虽然具有检测时间短和操作简便等优势，但是Chinonavanig、Kittigul和Amuy课题组的研究却都显示出这种方法的正确检出率低、检测灵敏度不高，而且存在明显的交叉反应，因此，就目前来看这种方法暂时还不适合应用于实际的蛇伤案件。虽然国外的研究一致显示了凝集测试法的不足，但是在国内，个别医院却已经采用这种测试方法对临床蛇伤进行鉴定[16]，并给出了相当正面的评价（约300例阳性鉴定结果中无1例出现交叉凝集抑制现象）。遗憾的是该医院并没有公布其凝集测试法的详细细节，所以我们无法了解到该方法的关键技术。就国内外对凝集测试技术的研究和使用来看，该方法虽然存在种种有待解决的关键问题，但还是具有相当强的应用潜力的。

4.3 生物传感器检测法（biosensor assay）

生物传感器是一种将生物学或仿生学信号感应部件连接或整合到传感系统内的分析仪器，主要包括敏感元件和信号转换元件两部分。生物传感器在使用过程中是通过固定在支持物上的敏感生物材料（即敏感元件）与分析物特异性结合，发生一种或多种物理化学特性的改变，然后由换能器转换为次级可用信号（通常是电信号），这种信号的强弱或频率的变化与敏感元件所结合的分析物或分析物化学基团相关，从而对待测物进行分析测定。

生物传感器进入蛇毒鉴定领域是源于Rogers等[17]1991年的研究，他将烟碱型乙酰胆碱受体固定在光纤上制成生物传感器，用以鉴定金环蛇蛇毒中的-银环蛇毒素。Rogers的传感器活性在最佳pH环境中可以保持3d，然后活性会逐渐降低，30d过后活性大致会损失50%。2005年，陶涛等[18]将生物传感器鉴定蛇毒的技术做了改进，他将石英晶振的高灵敏度与免疫反应的特异性相结合，研制出了检测蝮蛇毒的压电免疫传感器方法。但是在用纯蛇毒对其性能进行测试时，陶涛的鉴定装置在检测浓度和交叉反应方面并没有体现出特别的优势，检测限是0.1μg/mL，交叉反应也没能避免，而且制备完成的鉴定装置只能重复使用5次左右。继Rogers和陶涛之后，生物传感器鉴定蛇毒的研究鲜有报道。

生物传感器鉴定蛇毒具有体积小和检测时间短的优点，但是现阶段的产品却非常不成熟（仅处于对纯蛇毒进行鉴定的阶段），存在活性保持困难、重复使用次数少和交叉反应等问题，这严重限制了其在蛇毒鉴定领域的发展和应用，所以迄今未见生物传感器应用于蛇伤实际鉴定工作的报道。但是生物传感器毕竟具有便携和检测时间短的优点，如果其产品质量能够获得极大提升，那么还是具有应用价值的。

4.4 免疫学方法

4.4.1 放射免疫测定法（radio immunoassay，RIA）

放射免疫测定法是利用放射性同位素标记的抗原（标记抗原）和相对应的抗体来测定非标记抗原（标准抗原或待测抗原）的一种免疫测定方法。需要将标记抗原和非标记抗原同时与数量有限的特异性抗体发生竞争性结合（抗原-抗体反应）。由于标记抗原与待测抗原的免疫活性完全相同，对特异性抗体具有同样的亲和力，所以当标记抗原和抗体数量恒定且待测抗原和标记抗原的总量大于抗体上的有效结合点时，标记抗原-抗体复合物的形成将随着待测抗原量的增加而减少，而非结合的或游离的标记抗原则随着待测抗原数量的增加而增加（即竞争结合反应），因此测定标记抗原-抗体或游离的标记抗原即可推测出待测抗原的数量。

早在20世纪70年代，Sutherland等[19-20]就尝试将RIA用于蛇伤诊断，并从蛇伤患者的尿液和血清中成功检测到了相关毒素（Tiger snake毒素）。这是一次重要的研究，意味着现代医学有能力对生物样品中的蛇毒做出来源判断。继Sutherland的研究之后，1987年，Pukrittayakamee等[21]对RIA法的灵敏度和专属性做了改进。Pukrittayakamee运用鲁塞尔（Russell）蝰蛇蛇毒X因子的单克隆抗体构建用于检测伤者体液中鲁塞尔蝰蛇蛇毒的RIA方法。改进后的方法在灵敏度方面表现突出（检测限在尿液中为4 ng/mL，在0.1%牛血清白蛋白-磷酸盐缓冲液中为20 ng/mL，在血清中为5μg/mL），但是在交叉反应方面却并不理想，由于抗体的特异性不够，用该方法检测眼镜蛇蛇毒时也显示阳性。

RIA法需要用到放射性同位素，在检测完毕后对废弃物的处理是非常麻烦的事情。到了20世纪90年代，随着其他免疫学检测技术的兴盛（如：酶联免疫吸附技术、荧光免疫技术等），RIA法用于蛇伤鉴定的研究日渐式微。直到1996年，英国的Sjostrom[22]等才开发出了另一种用于检测血浆中极北蝰（Vipera berus berus）蛇毒的RIA方法，并且在测试过程中着重将这种方法与酶联免疫吸附法（ELISA）进行了对比。在对比测试中，Sjostrom的RIA方法只表现出了与ELISA方法相似的检测性能，并没有获得特别有吸引力的数据。这次的测试基本宣告了RIA退出蛇伤鉴定领域，在这之后的十几年中，还未见有新文献报道用RIA法来鉴定蛇伤。

4.4.2 免疫电泳检测法（immunoelectrophoresis assay）

免疫电泳是将琼脂电泳和双向琼脂扩散结合起来，用于分析抗原组成的一种定性方法。常规流程是先将抗原加到琼脂板的小孔内进行电泳，然后在琼脂板中央挖一横槽，加入已知相应的免疫血清，两者经一定时间相互扩散后，就会在抗原、抗体比例最适处形成沉淀弧。根据沉淀弧的数量、位置和外形，参照已知抗原、抗体形成的电泳图，即可分析样品中所含成分。此方法样品用量少、特异性高、分辨力强。但所分析的物质必须有抗原性，而且抗血清必须含所有的抗体组分。

1990年，曹金鸿和李碧晴[23-24]用交叉免疫电泳法和逆流免疫电泳法对白眉蝮蛇毒、黑眉蝮蛇毒、五步蛇毒、竹叶青蛇毒和烙铁头蛇毒进行了鉴别研究，这是我国学者第一次用免疫电泳法对中国境内常见蛇毒开展系统研究，研究结果也表明这2种免疫电泳方法确实能够区分不同种类的纯蛇毒。但遗憾的是曹金鸿和李碧晴并没有测试这2种电泳方法对生物样品中蛇毒的辨别能力，所以这2种方法对蛇伤的实际鉴定能力仍不清楚。

火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis，RIEP）是将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。电泳时，存在于琼脂凝胶中的抗体不发生移动，但在电场的作用下抗原会向正极泳动。当抗原与抗体分子达到适当比例时，形成一个形状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰，峰的高度与样品中的抗原浓度呈正相关。因此，当琼脂中抗体浓度固定时，根据样品的沉淀峰长度即可计算出待测抗原的含量。1993年，廖共山等[25]用这种方法研究了商品眼镜蛇毒抗血清与蛇毒成分产生的免疫沉淀线，发现眼镜蛇的细胞毒与同科异种蛇毒的细胞毒之间不会发生交叉免疫反应。然而，廖共山也没有用蛇毒生物样品对他的方法进行测试，这使得RIEP方法对蛇伤的实际鉴定能力仍是未知数。

曹金鸿、李碧晴和廖共山将免疫电泳法带入了蛇毒（体外检材）鉴定领域，为蛇毒鉴定提供了新的思路，但是考虑到当前电泳技术的分离能力和生物样品的复杂性，免疫电泳并不适合用于生物样品中蛇毒的鉴定。

4.4.3 光学免疫检测法（optical immunoassay，OIA）

光学免疫检测法是使用光敏元件作为信号转换器，利用光学原理工作的一种检测方法。需要将生物识别物质固化在传感器上，通过与光学器件的光相互作用，产生变化的光学信号，通过检测变化的光学信号来检测免疫反应。

2002年，新加坡国立大学的Dong等[26]将β-银环蛇毒素单克隆抗体与硅晶片结合，并配备以亲和素、生物素、辣根过氧化物酶显色系统，开发了一种检测蛇毒的光学免疫检测方法（AB-OIA）。Dong等开发的蛇毒AB-OIA鉴定方法堪称蛇伤鉴定技术的杰作，该方法完成一次蛇毒鉴定仅需25 min，检测灵敏度达到了惊人的16pg/mL。交叉反应的测试数据显示，该方法对于锯鳞蝰属蛇毒、死亡蛇属蛇毒和其它9种蛇毒成分在1～5μg/mL的毒素浓度水平上未发现交叉反应。在用含毒生物样品进行的测试中，Dong的ABOIA方法对正常组小鼠样品全部呈现阴性，对注毒组小鼠样品则全部呈现阳性。Dong的单克隆抗体ABOIA方法在检测性能上表现抢眼，但是鉴于目前对蛇毒蛋白质的研究还不充分，我们并不知道哪些毒蛋白是某种蛇类特有的，因此该方法具体推广起来有一定难度，但这并不影响该方法的价值，它是蛇伤鉴定技术的一次飞跃，将蛇毒鉴定的检测限带到了pg级。2004年，Dong等[27]又在原方法的基础上做了改进，这次他们放弃使用单克隆抗体，改用亲和纯化方法制备的蛇毒种属特异性抗体。Dong等将竹叶青蛇毒、孟加拉眼镜蛇毒、眼镜王蛇毒和红口腹蛇毒的抗血清分别用其它3种蛇毒处理以除去抗血清中能够发生交叉反应的抗体，然后用这4种抗血清建立了可用肉眼观察鉴定结果的蛇毒光学免疫检测方法（OIA）。该方法在毒素检测浓度和交叉反应方面的性能与2002年的方法非常相似，在用全血、血浆、尿液、伤口分泌物、疱液和组织匀浆样品开展的性能测试中表现优异。

蛇类的一次排毒量只有数毫克至一百多毫克，蛇毒进入人体后随着人体体液的稀释，浓度会急剧下降，因此鉴定方法的灵敏度对于鉴定能否成功至关重要。Dong等开发的光学免疫检测方法在体内蛇毒测试中，不但在交叉反应方面表现优秀，而且拥有极低的检测限，在蛇伤案件鉴定中无疑是具有重大应用价值的。4.4.4荧光免疫检测法（fluorescence immunoassay）

荧光免疫检测法是将荧光检测与免疫检测结合而成的一种免疫检测方法，具有很高的检测灵敏度。荧光免疫检测法需要先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体（或抗原），再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光，从而确定抗原或抗体的含量。

1988年，Lomonte等[28]首次用鼠单克隆抗体建立了一种用于检测粗鳞矛头蝮（Bothrops asper）蛇毒的酶联荧光免疫方法。这是非常重要的一次研究，它将荧光技术融入了蛇毒鉴定方法，还试图用单克隆抗体消除免疫方法鉴定蛇毒长期存在的交叉反应问题，但是由于选择的单克隆抗体不够理想，Lomonte的方法被发现可以与墨西哥跳蝮（B.nummifer）蛇毒产生明显的交叉反应。1993年，Bhatti等[29]也建立了用于检测山蝰（Vipera russelli）蛇毒的酶联荧光免疫法。相比于Lomonte的方法，Bhatti的方法在检测灵敏度方面可谓进步巨大，由1.5 ng/mL下降到了0.1pg/mL。然而，Bhatti也没能避免交叉反应，他选择的抗体与蝰科（Viperinae）和蝮亚科（Crotalinae）的蛇毒间存在明显的交叉反应。在Lomonte和Bhatti之后，新加坡的Gao[30]和美国的Gilliam[31]于2008年和2013年也分别建立了单珠荧光免疫法和荧光ELISA法用于蛇毒鉴定，但均未能克服交叉反应的影响。

荧光免疫检测是一种非常灵敏的检测技术，借助抗原-抗体结合的高特异性，对生物样品中的蛇毒进行专属鉴定也完全可行。但是，由于目前对蛇毒蛋白和蛇毒抗体的研究还不够全面，自Lomonte以来，该方法均因为缺乏特异性足够强的抗体与之相配套，而无法用于蛇伤实际案件的鉴定。

4.4.5 酶联免疫吸附检测法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA方法的基本原理是利用酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合形成酶标抗体，酶标抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合，滴加底物溶液后，底物可在酶作用下出现颜色反应，可以通过颜色反应是否出现来判定有无相应的免疫反应，而颜色的深浅是与标本中相应抗体或抗原的量呈正比的。在最近30年里，该方法在检测性能方面获得了长足进步。目前，ELISA方法已经成为蛇毒检测最常用的免疫学方法。

ELISA方法用于蛇毒检测是源于1977年Theakston[32]的一项研究。当时，Theakston和他的团队尝试将刚出现不久的ELISA新技术应用于临床蛇伤的鉴定，在随后的测试过程中，这种新方法表现出了令人满意的灵敏度，检测限可以达到1～5 ng/mL。这一次的尝试是ELISA法应用于蛇伤鉴定的开始，围绕ELISA方法的下一个重要发现来自于1981年Gopalakrishnakone[33]的研究。为了弄清蛇毒抗血清的特异性，Gopalakrishnakone等用南美响尾蛇（Crotalus durissus terrificus）的抗血清建立了ELISA流程来研究与多种蛇毒磷酸酯酶A2的反应。这项研究第一次揭示了蛇毒蛋白质成分的相似是免疫学方法鉴定蛇毒时交叉反应产生的基础，为交叉反应的克服提供了理论基础。

交叉反应的存在对于蛇伤临床治疗是有利的，但是对于蛇伤的准确鉴定却是非常不利的[34]。为了克服免疫学方法鉴定蛇伤时存在的交叉反应，以Barral-Netto为首的一些学者开始尝试制备蛇毒中单一组分的多克隆抗体并将其用于蛇毒鉴定。Barral-Netto等[35]从南美响尾蛇（Crotalus durissus terrificus）蛇毒中纯化出了单一毒素成分：响尾蛇毒素（crotoxin），并制备了这种毒素的多克隆抗体。利用这种抗体建立的ELISA方法其交叉反应强度明显降低，只是当其它毒素的浓度达到1μg/mL时才出现交叉反应，可以说是ELISA法鉴定蛇毒的一次重大突破。1994年，Li等[36]运用与Barral-Netto相似的方法建立了宽带铜斑蛇（Agkistrodon contortrix laticintus）蛇毒的鉴定方法，同样获得了不错的检测性能。测试结果显示，该方法对蝮蛇属（Agkistrodon species）的其它蛇毒没有明显的交叉反应，仅对矛头蝮属（Bothrops species）的2种蛇毒存在明显的交叉反应。

蛇毒单一毒素多克隆抗体的应用大大降低了ELISA法鉴定蛇毒时的交叉反应，但是交叉反应在一定范围内仍然存在并继续困扰着低浓度蛇毒样品的鉴定。为了进一步克服交叉反应，一些学者开始将单一毒素的单克隆抗体引入蛇毒ELISA鉴定方法。在这个方向上的第1次尝试是由瑞典的Amuy团队完成的。1997年，Amuy等[37]制备了中美珊瑚蛇（Micrurus nigrocinctus）蛇毒的单克隆抗体并将其与多克隆抗体进行了对比测试，使用单克隆抗体的ELISA方法表现出了更低的交叉反应强度。在这之后，巴西的Fernandes[38]于 2010年再次用三色矛头蝮（Bothrops asper）蛇毒金属蛋白酶BaP1的单克隆抗体研究ELISA鉴定蛇毒的交叉反应，同样获得了令人满意的结果。Fernandes在研究中用了27种异种蛇毒做交叉反应测试，这是迄今为止最为全面的一次测试，测试结果再次证明了蛇毒单克隆抗体可以有效降低交叉反应的发生。

在Amuy和Fernandes做蛇毒单克隆抗体研究的同时，另一些学者却在尝试采用经亲和纯化的多克隆抗体来鉴定蛇毒。其原理是将异种蛇毒包被在经活化的色谱载体上，让目标蛇毒的抗血清流经色谱柱，收集流出液即为蛇毒种属特异性抗体，然后用这种抗体来构建ELISA鉴定方法。在目前对蛇毒蛋白质认识不足、特异性单克隆抗体很少的情况下，这种方法具有很高的实用价值。自20世纪90年代以来，很多学者采用这种抗体开展的体内外蛇毒研究结果也证实了蛇毒种属特异性抗体拥有优异的检测特异性[39-44]。

在检测灵敏度方面，随着生物素-亲和素（Biotin-Avidin，BA）放大系统被引入到 ELISA方法中[45-46]，目前的ELISA法鉴定蛇毒的灵敏度已经达到了pg级。

就生物样品中蛇毒鉴定的灵敏度、特异性以及鉴定方法实施的难易程度来看，ELISA法是目前蛇毒免疫学鉴定方法中的最佳选择。

4.5 质谱法（Mass Spectrometry，MS）

20世纪80年代，随着电喷雾离子化（Electrospray Ionization，ESI）技术和基质辅助激光解析离子化（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization，MALDI）技术的出现，用质谱分析蛋白质成为了可能。质谱法鉴定蛋白质的原理是运用不同离子化方法将样品中的组分解离为气相离子后，根据不同离子质荷比（m/z）的差异进行分离，从而鉴定蛋白质。因为质谱法具有高通量、高灵敏度、可自动化等优点，所以在蛋白质鉴定领域迅速扩展。近十年来，质谱技术也频频出现在蛇毒蛋白的研究领域。

4.5.1 基质辅助激光解析离子化质谱法（MALDI-MS）

基质辅助激光解析离子化是用基质包裹样品分子，在激光照射下，基质气化将样品分子释放到气相中的技术。这是一项软电离技术，非常适合生物大分子的电离。

2003年，英国的Creer等[47]用基质辅助激光解析飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）研究了台湾及周边岛屿蝮蛇（pit viper）蛇毒的种间变异。他们从蛇毒中鉴定到了大量蛋白质，从中寻找到了7种不同的磷酸酯酶A2（PLA2）及异构体，迈出了MALDI-MS鉴定蛇毒蛋白质精细差异的第一步，也证明了MALDI-MS有能力区分不同种类的蛇毒。同年，台湾的Nawarak等[48]也用多维色谱技术结合MALDI-MS研究了眼镜蛇科（Elapidae）和蝰科（Viperidae）共 10 种蛇毒在蛋白质组成方面的差异（种内差异、种间差异和科间差异）。在这项研究中，Nawarak共鉴定到了133种蛋白质，从中筛选出了各种蛇毒特有的蛋白质，这是第一次用MALDI-MS对蛇毒蛋白进行大规模的横向比较。但是Nawarak的研究也暴露出了多维色谱技术结合MALDI-MS检测蛋白质的缺点：获得的数据量偏小。

Creer和Nawarak的研究为MALDI-MS在蛇毒蛋白质组学研究中的应用打下了坚实的基础，此后，很多研究人员陆续用类似的方法对各种蛇毒开展了与蛇毒进化、蛇种归属和蛇类发育等相关的研究[49-54]，获得了丰富的数据，极大的推进了MALDI-MS在蛇毒蛋白质组学中的应用。

4.5.2 电喷雾离子化质谱法（ESI-MS）

电喷雾离子化是一种在大气压下实现电离的技术，其原理是利用毛细管和质谱仪进口间的电势差生成离子，在电场作用下产生以喷雾形式存在的带电液滴，当使用干燥气加热时，溶剂蒸发，液体体积缩小，最终生成去溶剂化离子。电喷雾电离的特点是可以生成高度带电的离子而不发生碎裂，可以极大的降低质荷比，非常适合于检测生物大分子。

2002年，澳大利亚的Fry等[55]用高效液相色谱（HPLC）结合ESI-MS技术研究了澳大利亚4种死蝰（death adder）的蛇毒蛋白，发现这4种蛇毒组分最明显的特点是多样化，研究结果对于确定死蝰的分类地位和系统学关系很有帮助。2003年，Fry等[56]继续用HPLC结合ESI-MS技术研究蝰蛇（5种）、眼镜蛇（15种）和有毒游蛇（22种）的毒液蛋白，这是迄今为止最大规模的蛇毒蛋白质组学研究。在这项研究中，Fry等发现不同的蛇毒在蛋白质组成上差异明显，他们还在游蛇科蛇毒中发现了一些常见于眼镜蛇科和蝰蛇科的毒素蛋白（3指毒素和富含半胱氨酸的分泌蛋白），这些发现对于蛇毒鉴定和蛇伤鉴定都有着重要意义。

Fry课题组的研究对于ESI-MS用于蛇毒蛋白质检测是具有里程碑意义的，在这之后，涌现出了大量用ESI-MS研究蛇毒蛋白质的文献[57-61]。为了进一步追求蛇毒蛋白质鉴定的数量，也有一些课题组将ESI-MS和MALDI-MS方法结合起来研究蛇毒[62-67]，但是，遗憾的是这些研究普遍都只着眼于纯蛇毒的蛋白质鉴定，而没有开展生物样品中蛇毒蛋白质的研究，也没有关注蛇毒中毒生物体内生物标记物的发现。这一状况直到2011年才由哥斯达黎加的Rucavado[68]打破。Rucavado给小鼠注射Bothrops asper蛇的蛇毒，然后收集伤口分泌物，用LC-MS对分泌物中的内源蛋白质进行鉴定，共鉴定到340个内源蛋白质，主要包括细胞内蛋白、血浆蛋白、细胞外基质蛋白和细胞膜相关蛋白，这些蛋白质的出现表明Bothrops asper蛇毒可以造成细胞破坏、胞浆渗出、细胞外基质降解和膜蛋白脱落，其中一些蛋白质甚至有可能成为Bothrops asper蛇毒导致的心肌坏死和微血管损伤的生物标记物。Rucavado的研究对于蛇伤鉴定意义重大，该研究将目标首次瞄向了生物标记物，为蛇伤鉴定指出了新的方向。继Rucavado之后，巴西的Paes Leme[69]也开展了重要的研究工作，他用LC-MS/MS研究了蛇毒基质金属蛋白酶（HF3，来自于Bothrops jararaca蛇毒）的出血活性，率先将蛇毒单一毒素与中毒动物内源蛋白质的变化联系了起来。Paes Leme将HF3分别注入小鼠背部皮下和腿部肌肉，然后收集背部皮肤和血浆，与对照组相比分析其中的差异蛋白质。在这项研究中，细胞外基质、细胞溶质、细胞骨架和胞浆蛋白被发现在中毒皮肤中降解明显，而在血浆中降解最明显的则是纤连蛋白。Rucavado和Paes Leme开辟了蛇伤研究的新领域，这对于蛇伤鉴定和蛇伤治疗都具有重要意义。

质谱法用于蛇毒研究在近十年来获得了快速发展，积累了大量的蛋白质数据和研究经验，这为蛇毒中毒机理的深入研究提供了新的舞台，也为蛇伤鉴定做了新的铺垫。未来，这一领域将是蛇伤研究的重点领域之一。

5 问题与展望

蛇毒蛋白是蛇毒的毒性成分，不同蛇类其毒素蛋白质的组成是不同的，在某种意义上，蛇伤鉴定也就是鉴定生物样品中的蛇毒蛋白质，从而对肇事蛇种做出推断。根据当前的数据，全世界的毒蛇约650余种，分别属于前沟牙类毒蛇、后沟牙类毒蛇和管牙类毒蛇，但已经开展蛇毒蛋白质组学研究的毒蛇仅有100多种，这表明我们对蛇毒蛋白所知甚少，将大大影响蛇毒鉴定的准确性。因此，建立详细而全面的蛇毒蛋白质数据库，解决蛇毒蛋白质研究中的生物信息学瓶颈，可能仍是未来很长一段时间内的研究重点。

在目前阶段，免疫学方法是鉴定蛋白质的主要手段，因此其也顺理成章成为生物样品中蛇毒蛋白鉴定的主要研究方向，并获得了很大进展。但纵观早期的蛇伤免疫学鉴定方法，我们可以看到存在大量蛋白间的交叉反应，以至于很多方法只是停留在实验室研究阶段，并没有进入临床应用。近期的蛇伤免疫鉴定方法主要是应用经免疫亲和柱纯化的抗血清或经严密筛选的单克隆抗体来实施的，这2种方法在原理上是可以避免鉴定中的交叉反应，为蛇伤鉴定带来准确结果的，但是，这2种方法在蛇伤鉴定研究中起步较晚，至今也只有极少数商品化蛇毒鉴定试剂盒供应。免疫法鉴定蛇伤虽然还存在一些需要解决的关键问题（主要是特异性抗体的筛选），但其发展前景无疑是非常光明的，其所具有的高灵敏度和快速响应等优点非常适合临床应用。未来，在解决了抗体特异性的问题以后，免疫法鉴定蛇伤可能被临床广泛接受。

另一个有发展前景的鉴定方法是质谱法，但该方法起步较晚，相对于免疫方法其基础薄弱、数据积累少，而且目前的质谱法鉴定蛋白质存在耗时过长和仪器操作过于复杂的缺点，还不适宜临床大规模应用。但值得注意的是，近10年来生物大分子质谱鉴定技术的快速发展和仪器的快速改良向我们展示了它的潜力，而且质谱技术一次可以鉴定上千个蛋白质，让我们可以用蛋白质群来对蛇毒做出归属，这对于提高鉴定准确性非常有利，无疑是非常有吸引力的。随着质谱鉴定蛋白质流程的快速化、仪器的简单化，质谱法也必将在蛇伤鉴定中发挥重要作用。

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