136例中国北方汉族人群经典型霍奇金淋巴瘤与EB病毒感染的相关性研究*

2014-02-03付骞千纪洪媛张甜甜高大林翟琼莉

中国肿瘤临床 2014年10期

付骞千纪洪媛张甜甜高大林吴玉刘乐翟琼莉

付骞千①纪洪媛②张甜甜①高大林①吴玉③刘乐①翟琼莉①

目的：EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染与多种肿瘤的发生关系密切，现已证实EBV感染与经典型霍奇金淋巴瘤（Classical Hodgkin lymphoma，CHL）发生关系尤为密切，但CHL患者中EBV检出率因种族、地域、性别和年龄的不同而有所差异，本研究目的在于探讨中国北方地区CHL发病与EBV感染的相关性。方法：用原位杂交的方法检测136例确诊为CHL病例中EBV编码的小RNA（Epstein-Barr virus encoded RNA，EBER）。结果：在136例CHL患者中EBER的总阳性率为28%（37/136），其中混合细胞型（mixed cellularity，MC）阳性率最高为49%（23/47）（P＜0.001），其次为富于淋巴细胞型（1ymphocyte rich，LR）30%（3/10），结节硬化型（nodular sclerosis，NS）14%（10/73），淋巴细胞消减型（1ymphocyte depletion，LD）0例（0/2）。CHL发病年龄呈单峰分布，主要在21～30岁年龄组。NS型在21～30年龄组出现一个明显单峰，而MC型在41～50岁年龄组存在一个略低的峰，EBER阳性率在0～10岁和41～50岁这两个年龄组分别有两个峰值（21.6%和24.3%）。结论：中国北方汉族人群CHL的发病与EBV的感染有一定的关系，其中以MC与EBV的关系较为密切。

经典型霍奇金淋巴瘤 EB病毒原位杂交 EBV编码的小RNA

1987年Weiss等［1］用Southern Blot方法首次在霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）组织中检测出EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）的DNA，此后，随着免疫组化、PCR以及更为敏感的原位杂交方法的发展，流行病学、分子生物学及免疫学等方面的研究结果均显示：某些类型的HL确实与EBV感染存在密切相关性，但是不同地理环境、社会经济、种族人群、年龄的HL患者与EBV相关性有很大的差异［2］。目前国内相关研究多来自新疆及沿海地区，故本研究采用原位杂交的方法回顾性检测了本院收治的136例汉族经典型霍奇金淋巴瘤（Classical Hodgkin Lymphoma，CHL）患者中EBV编码的小RNA（Epstein-Barr virus Encoded RNA，EBER），以探讨中国北方汉族人群经典型霍奇金淋巴瘤与EBV感染的相关性。

1 材料与方法

1.1 标本来源及其临床资料

收集天津医科大学肿瘤医院2000年12月至2013年12月期间136例CHL病例，由两名病理医生复查病理切片，完善免疫组化并收集临床资料，所有病例均按2008年WHO淋巴瘤标准分类。

1.2 方法

1.2.1 标本处理以上标本均经常规中性福尔马林固定，石蜡包埋。采用表面经硅化包被的防脱载玻片，4 μm连续切片备用。

1.2.2 免疫组化检测每例标本均进行CD3、CD15、CD20、CD30、Pax-5、LCA等免疫组化染色，所有一抗试剂均为北京中杉金桥生物技术有限公司即用型抗体。染色采用EnVision两步法：切片常规脱蜡水化，组织抗原经高压热修复后加入3%H2O2室温孵育10 min，PBS冲洗3次；滴加一抗，4℃过夜；PBS冲洗后滴加二抗室温孵育30 min，PBS冲洗3 min×3次；DAB显色，苏木素复染，氨水返蓝，梯度酒精脱水后中性树胶封片。每次染色均设空白对照（PBS）和阳性对照。

1.2.3 EBER原位杂交试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司代理的美国PanPath公司REMBRANT原位杂交试剂盒。寡核苷酸探针为地高辛标记。选取已知EBV阳性的鼻咽癌组织标本为阳性对照，以PBS液代替杂交液作为阴性对照。具体步骤按照操作说明进行：石蜡切片脱蜡后过无水乙醇5 min，自然干燥；经胃酶湿盒消化37℃30 min后梯度乙醇脱水（70%、95%、100%），自然干燥；滴加适量探针并加盖盖玻片，橡胶水泥封片37℃湿盒过夜孵育16 h；除去橡胶水泥后以PBS缓冲液浸泡切片10 min至盖玻片脱落，再用PBS液清洗2 min×3次；滴加适量辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体37℃孵育30 min，PBS液冲洗3次，蒸馏水浸泡1 min；DAB显色，苏木素复染，氨水返蓝，梯度酒精脱水后中性树胶封片。

1.2.4 结果判断 CHL瘤细胞指双核经典Reed-Ste rnberg细胞（R-S细胞）及变异型R-S细胞。免疫组化阳性判断标准：CD15、CD30均为瘤细胞胞膜棕黄色着色，Pax-5为瘤细胞胞核棕黄色着色；EBER检测阳性判断标准：肿瘤细胞核内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞，而胞质和胞膜着色及背景细胞着色不能视为阳性。高倍视野下（×400）观察到1个阳性细胞以上为阳性病例（图1）。

图1 CHL组织中Pax-5、CD30，EBER检测（Envision×400）Figure 1 HE staining and immunohistochemical patterns of Pax-5，CD30，and EBER

1.3 统计学处理

采用SPSS 12.0软件进行统计处理，组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料分析

136例CHL患者中，NS型73例（55%）明显多于其他亚型（P＜0.001），其次为MC型47例（36%），LR型10例占8%，LD型发病率最低，仅2例（1%），另外未能分类（not otherwise specified，NOS）4例（表1）。

在136例CHL中男性患者84例，女性患者52例，男女比例1.6：1。年龄分布：0～10岁组8例（5.9%），11～20岁组 23例（16.9%），21～30岁组 34例（25.0%），31～40岁组25例（18.4%），41～50岁组21例（15.4%），51～60岁组15例（11.0%），61～70岁组9例（6.6%），71～80岁组1例（0.7%），中位年龄为31.5（4～72）岁。年龄构成比呈现单峰分布，主要在21～30岁年龄组发病例数最多（P＜0.001）。其中NS亚型在21～30岁年龄组出现一个明显高峰，而MC亚型在41～50岁年龄组有一个略低的峰（图2）。

2.2 EBER结果分析

136例患者中EBER原位杂交检测显示阳性结果37例（27.2%），其中男性26例，女性11例，男女比例2.4：1。37例EBER阳性病例中MC型23例（64%），NS型10例（28%），LR型3例（8%），LD型0例，NOS型1例。MC型明显多于其他类型（P＜0.001），两组中男女性别比差异无统计学意义（P=0.212），中位年龄差异无统计学意义（表1）。

EBER阳性组中年龄分布：0～10岁组8例（21.6%），11～20岁组3例（8.1%），21～30岁组4例（10.8%），31～40岁组3例（8.1%），41～50岁组9例（24.3%），51～60岁组4例（10.8%），61～70岁组5例（13.5%），71～80岁组1例（2.7%），中位年龄42（4～72）岁。EBER阳性病例在0～10岁和41～50岁这两个年龄组分别有两个峰值（21.6%和24.3%，图3），EBER阳性病例仅在21～30多年龄组存在单峰年龄组分布上差异有统计学意义（P＜0.001）。

表1 136例中国北方汉族CHL患者石蜡组织中EBER表达与性别、组织学分型间的关系Table 1 Correlationship between EBER expression and sex,and the histologic grade in 136 cases of patients with CHL from Northern Chinese Han population

图2 136例CHL总体和NS、MC亚型在各年龄组的发病情况Figue 2 Age distribution of all patients and NS、MC subtypes in consecutive 10-year intervals

图3 EBER阳性病例在0～10岁年龄组和41～50岁年龄组有两个峰值，EBER阴性病例只在21～30年龄组存在单峰Figure 3 The incidence of EBER positive group identified a bimodal age distribution with two peaks at the first and fifth decades respectively, while only single age peak at the third decades in EBER negative group

3 讨论

CHL发病率占恶性肿瘤的1%，占淋巴瘤发病率的30%［3］，高加索人发病率最高，其次是南美和西班牙人，而亚洲人发病率最低［2］。其原因可能是由社会经济状况、种族背景、遗传易感性不同而造成的。在西方一些发达国家CHL的发病率呈现双峰分布（混合细胞型），第一个峰在25岁左右，第二个峰在60岁左右，而有关东方人CHL发病率的研究报道显示第一个峰通常出现在儿童时期，第二个峰出现在老年时期。这种流行病学特点也提示第一个高峰可能与EBV感染因素有关，在发展中国家，EBV初次感染发生较早，而在发达国家由于社会经济等多种原因使得初次感染延迟［4］。本研究显示在我国北方地区汉族人群CHL发病年龄分布呈现偏态单峰分布，在21～30岁年龄组发病数最多，研究结果有统计学意义（P＜0.001），此峰值与Huang等［5］对157例中国北方CHL患者的研究结果一致，说明本研究中我国北方地区汉族人群CHL的第一个发病高峰与西方国家的报道相同。但是本研究未显示第二个发病峰值，且单独对各种亚型分析，特别是MC亚型，也未见明显双峰，这可能是由于本研究对象中老年病例较少所致。

检测EBV感染的常用方法有免疫组化法检测潜伏膜蛋白（laten membrane proteins，LMP-1），原位杂交法检测EBER以及PCR方法检测EBV的DNA，3种方法中以PCR方法最为敏感，但结果不稳定，易受外界因素影响，可重复性差，易出现假阴性或假阳性。并且此技术手段不能区分病毒DNA来自于肿瘤细胞还是周围其他淋巴细胞，只能解释为有EBV的感染，是否有RNA的转录以及蛋白表达却无法得知，因此特异性较低［6］。免疫组化方法可以检测EBV的蛋白产物LMP-1并将其定位于H/RS细胞的胞膜或胞质内，但是对于细胞内低拷贝数RNA的EBV检测存在一定的假阴性率。相对而言原位杂交的方法检测的是EBV编码的小RNA，这种小分子RNA结构稳定且不容易被降解，主要反映DNA的转录情况，因此在病毒潜伏期和复制期均有表达，其阳性信号定位于H/RS细胞核上，呈棕黄色颗粒，易于辨认。因此在EBV感染的检测上，采用原位杂交检测EBER的方法是检测EBV感染最为敏感的指标［7］。因此本实验以原位杂交作为检测手段。

EBV感染与CHL的相关性在世界很多地方都有研究，然而目前所报道的CHL中的EBV检出率在发达国家及发展中国家存在很大差异，西方检出率为29%～79%［8-11］，我国学者研究显示CHL组织中EBV阳性率为52%～82%。本实验中EBER阳性率为27.2%（37/136），虽略低于以往国内报道，但与Zhang等［12］对19例中国地区汉族HL患者EBER阳性率（26.3%）的研究结果及Huang等［5］对157例中国北方CHL患者的研究结果相近。我们分析原因可能有以下几点：

首先，EBV的感染情况可因地域不同而存在差异。齐宗利等［6］对广州地区39例HL中EBV进行测定结果显示EBER阳性率为69.2%。郑雄伟等［13］对福建地区74例HL蜡块进行EBV检测阳性率为51.4%，这两组数据略高可能是由于沿海地区人口流动频繁易造成EBV感染。

其次，种族背景的不同也会影响EBV的易感性。藏素红等［14］对27例维吾尔族HL患者采用原位杂交检测EBER阳性率为81.5%（22/27）。李迅等［15］对40例维吾尔族HL患者标本进行EBER检测，阳性率为65.0%（26/40），明显高于本研究结果，我们猜测维吾尔族人HL患者EBV的检出率相对多于其他民族，可能与其民族具有部分北欧血统有关。这一推论也可以和高加索人EBV检出率最高的研究结果相吻合［2］。

第三，EBV感染情况与CHL组织学亚型关系密切。在本组病例中MC和LR型EBV阳性率较高，分别为49%（23/47）和30%（3/10），表明MC型和LR型与EBV感染的相关性最为密切，这也与众多研究结果相似［7，13］。但本研究整体病例以原本EBV阳性率（14%）略低的NS型为主（73/136），因此使得总体EBV检出率下降。

第四，不同年龄组的患者EBV检出率差异较大，儿童与老年CHL患者EBV感染率更高［16］。西方发达国家儿童HL患者的EBV感染率仅有20%～25%［17］，而我国90%儿童HL患者都存在EBV的感染［13］。Zhou等［18］对中国104例儿童HL和52例成人HL的EBV感染进行了分析，发现89%儿童HL和38%成人HL有EBV感染。特别是10岁以下儿童感染率可高达95%，并且儿童HL EBV感染与组织学类型无关，即每种类型的HL均与EBV有密切关系，在本研究中8例0～10岁年龄组的患者EBER均为阳性，这也提示儿童HL是EBV相关的独立疾病。也有部分学者认为儿童与老年人EBV+HL发病率较高可能与儿童及老年人免疫能力相对低下，环境因素及人体基因易感性有关［19］。以往的研究结果显示初次感染EBV时患者年龄是罹患HL的重要因子，在儿童期感染EBV的患者（多见于发展中国家），多无明显症状，病毒与患者呈长期伴随关系；如青少年时期初次感染EBV（多见于发达国家）常会患传染性单核细胞增多症，而此病又会使年轻人患HL的危险性增加至少2.5倍［20］。而老年人患HL的原因可能是由于潜伏性的EBV感染与宿主免疫系统失衡所致。本组研究中虽然0～10岁组和71～80岁组共9例患者EBER均为阳性，但占总体病例百分比很小，因此导致总体EBV检出率低于其他国内报道。

最后，随着经济的发展，生活条件改善，与之相应的EBV感染情况也会得到控制，这也可能是本研究中EBER阳性率较低的部分原因。同时本研究发病峰值在21～30岁年龄组也可以由经济发展带来的EBV延迟感染来解释。

综上所述，CHL与EBV感染关系密切，中国北方汉族人群CHL特别是MC亚型发病与EBV感染相关性更大，儿童和老年患者EBV检出率可高达100%。检测EBV的状态对于CHL诊断及鉴别诊断十分重要，EBV在HL发病机制中的作用仍在研究之中。

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（2014-03-11收稿）

（2014-05-01修回）

Association between classical Hodgkin's lymphoma and Epstein-Barr virus infection in Northern Chinese Han population

Qianqian FU1,Hongyuan JI2,Tiantian ZHANG1,Dalin GAO1,Yu WU3,Yue LIU1,Qiongli ZHAI1

Qiongli ZHAI;E-mail:zhaiqiongli@126.com
1Department of Pathology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Sino-American Diagnostic and Therapeutic Center for Hematological Malignancies(Tianjin),Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060;2Department of Pathology,Tianjin Jixian People's Hospital,Tianjin 31900;3Department of Endocrinology,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China

Objective:The occurrence of numerous tumors,particularly classical Hodgkin's lymphoma(CHL),is related with Epstein-Barr virus(EBV)infection.However,the incidence of CHL and its association with EBV varies significantly with ethnicity,geographic location,sex,and age.This study investigated the association of EBV infection with CHL in Northern Chinese Han population.Methods:EBV-encoded small RNA(EBER)was detected in 136 cases of CHL through in situ hybridization.Results:A total of 37 cases were EBER positive(28%).The mixed cellularity(MC)subtype had the highest positive EBER rate of 49%(23/47;P<0.001),followed by lymphocyte-rich subtype with 30%(3/10),nodular sclerosis(NS)subtype with 14%(10/73),and 1ymphocyte depletion with 0%(0/2).Our study identified a single age distribution in the third decade.Moreover,NS subtype showed an evident single peak in the third decade.However,MC subtype had a lower peak in the fifth decade.The incidence of EBER showed a bimodal age distribution with two peaks in the first and fifth decades(21.6%and 24.3%,respectively).Conclusion:CHL in Northern Chinese Han population was associated with EBV infection,particularly the MC subtype.

classical Hodgkin's lymphoma,Epstein-Barr virus,in situ hybridization,Epstein-Barr virus encoded RNA

10.3969/j.issn.1000-8179.20140394

①天津医科大学肿瘤医院病理科，国家肿瘤临床医学研究中心，中美淋巴血液肿瘤诊治中心（天津），天津市肿瘤防治重点实验室（天津市300060）；②天津市蓟县人民医院病理科；③天津医科大学总医院内分泌科

*本文课题受国家自然科学基金项目（编号：81272361）资助

翟琼莉 zhaiqiongli@126.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81272361)

郑莉）