IL－23 mRNA在慢性牙周炎牙龈组织中的表达

张 旭，尚光伟，陈富波，房 莉，余 芳，谢云峰，文海燕，唐小山

(同济大学附属上海第十人民医院口腔科，上海 200072)

IL－23 mRNA在慢性牙周炎牙龈组织中的表达

张 旭，尚光伟，陈富波，房 莉，余 芳，谢云峰，文海燕，唐小山

(同济大学附属上海第十人民医院口腔科，上海 200072)

目的:比较观察健康牙龈和慢性牙周炎牙龈组织中IL－23基因的表达水平。方法:选择活动期慢性牙周炎患者23例，牙周健康者15例，分别记录各受试牙的牙周临床指标后，采集牙龈组织标本，用实时定量PCR方法定量检测IL－23 mRNA在不同牙龈组织中的表达水平;并用Spearman秩相关分析IL－23与各牙周指标的相关关系。结果:慢性牙周炎组牙龈组织IL－23 mRNA表达量(0.0060±0.0034)显著高于正常对照组(0.0034±0.0018)(P＜0.05);慢性牙周炎组牙龈组织中的IL－23 mRNA表达量与牙龈指数、牙周袋探诊深度、附着丧失水平均呈正相关(P＜0.05)。结论:IL－23在慢性牙周炎发病机制中可能发挥重要作用。

慢性牙周炎;白介素－23;实时定量PCR

［牙体牙髓牙周病学杂志，2014，24(1):30］

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2014，24(1):30］

慢性牙周炎引起的牙周组织破坏主要是由宿主过度免疫炎症反应过程中产生的一系列炎症介质和细胞因子所介导。白细胞介素－23(IL－23)是2000年新发现的诱导炎症反应的促炎性细胞因子之一，属于IL－6/IL－12家族，主要由活化的单核巨噬细胞和树突状细胞所分泌［1］，在炎症性骨吸收中起重要的调节作用。IL－23是维持和稳定Thl7细胞(辅助性T细胞17，Thelp cell 17)的重要因素［2］，缺乏IL－23的小鼠体内几乎没有 Th17细胞的存在，发生自身免疫病的症状也较轻［3］。有学者认为IL－23/Th17/IL－17通路是调节牙周炎等以骨吸收为特征的炎症性疾病发生发展的关键因素［4］。本研究通过检测IL－23 mRNA在处于进展期的中重度慢性牙周炎患者牙龈组织中的表达水平，初步探讨IL－23可能在牙周病发病机制中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

RNAlater保存液(Qiagen公司，德国);Trizol(Invitrogen Life Technologies公司，美国);RT－PCR试剂(Takara公司，日本);SYBRgreen Realtime－PCR试剂盒(TaKaRa公司，日本);超微量分光光度仪(GE公司，美国);7900HT fast荧光定量PCR仪(ABI公司，美国)。

1.2 受试对象选择

2012－10—2013－02 从上海第十人民医院口腔科诊断为慢性牙周炎(探诊出血阳性，PD≥5 mm，CAL≥3 mm，牙槽骨吸 ＞根长1/2)的患者中，按赵川江等［5］提出的牙周炎活动期临床标准选取磨牙牙周袋溢浓、近期松动度加重，且需拔出者23例(男12例，女11例，平均年龄46.2岁)作为实验组。同时选取有第三磨牙阻生需拔除，且该牙牙周组织健康(口腔卫生状况良好，牙龈无红肿，龈沟深度≤2 mm，牙槽骨无吸收)者15例(男9例，女6例，平均年龄38.4岁)作为健康对照组。所有受试者均知情同意，无全身性疾病，3个月内未服用抗生素及非甾体抗炎药物，近6个月未进行过牙周治疗，不吸烟，女性无妊娠。

1.3 受试牙牙周临床指标检测

分别检测并记录各受试牙的牙龈指数(GI)、牙周探诊深度(PD)、附着丧失水平(AL)。GI按Loe＆Silness［6］的分级标准分为 0、1、2、3 级;PD、AL按《牙周病学》标准检查方法测每个牙的颊测3个位点，取其均值。

1.4 牙龈组织中IL－23基因的检测

1.4.1 牙龈样本采集和常规组织学观察

慢性牙周炎组在拔除受试牙时于患牙颊侧距龈缘3 mm处行内斜切口(深至根面)，切取包括牙周袋袋壁的牙龈组织;对照组在拔除阻生牙时切取牙龈组织。所采集的牙龈组织立即用灭菌生理盐水冲洗后，各分为两份，1份用40g/L多聚甲醛固定制作石蜡切片，HE染色观察牙周炎活动期病理变化;另1份立即置RNAlater保存液中－20℃保存备用。

1.4.2 定时定量PCR检测IL－23mRNA表达

取RNAlater中保存的组织样本，液氮冷冻下研磨后，加入Trizol匀浆裂解细胞，并严格按照Trizol说明书提取总RNA;分别经微量分光光度计和10g/L琼脂糖凝胶电泳检测确定A260/280在1.8～2.0，RNA 完整后，取1 μg按逆转录试剂盒说明书合成cDNA。条件:37℃，15 min;85℃，5 sec。cDNA稀释3倍作为模板在荧光定量PCR仪上测定各样本中IL－23 mRNA表达情况。所用引物用primer 3专业引物设计软件进行设计，并由invitrogen公司合成，各引物序列如下:IL－23＇上游引物5'－ TGGGACCTGCATATGTTGAA－3＇，下游引物5'－CCAAATTTCCCTTCCCATCT－3＇，产物长度97 bp;GAPDH上游引物5'－AATGAAGGGGTCATTGATGG－3＇，下游引物5'－ AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA－3＇，产物长度108 bp。

反应体系共25 μL，分别为:SYBR Premix EX Taq(TaKaRa 公司)12.5 μL、F－primer(10 pmol/μL)0.5 μL、R－prime(10 pmol/μL)0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O补至 25 μL。反应条件为:95℃ 5 min;95℃ 5 sec，60℃ 30 sec，40 cycles。反应结束仪器自动生成循环阈值(cycle threshold，Ct值)，用IL－23与内参基因GAPDH的 Ct值差值(△Ct)表示IL－23 mRNA相对含量。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，两组间比较用独立样本t检验;IL－23与牙周临床指标的相关程度采用Spearman秩相关分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 慢性牙周炎牙龈和健康牙龈中IL－23 mRNA表达的比较

常规组织学(HE)观察显示，所有慢性牙周炎牙龈组织均有大量炎症细胞浸润，胶原纤维水肿、变性，符合《口腔组织病理学》第6版关于牙周炎活动期的病理变化。而对照组则未见明显炎症病理表现。RT－PCR检测显示，慢性牙周炎牙龈组织中 IL－23 mRNA 相对表达量为0.0060 ±0.0034，高于健康牙龈的0.0034±0.0018，两组间差异有统计学意义(P ＜0.05)(图1)。

图1 两组牙龈组织中IL－23 mRNA表达水平比较

图2 IL－23 mRNA与GI相关分析(r=0.531)

图3 IL－23 mRNA与PD相关分析(r=0.444)

图4 IL－23 mRNA与AL相关分析(r=0.504)

2.2 IL－23 mRNA与各牙周临床指标的相关性分析

慢性牙周炎组和健康组各牙周临床指数见表1，Spearman秩相关分析显示:IL－23 mRNA表达水平与牙龈指数、牙周袋探诊深度、附着丧失水平均呈正相关关系(P＜0.05)(图2～4)。

表1 慢性牙周炎组和对照组各牙周临床指标(±s)

表1 慢性牙周炎组和对照组各牙周临床指标(±s)

组别 牙龈指数(GI)牙周袋深度(PD)附着丧失(AL)2.28 ±0.27 7.38 ±1.22 5.28 ±1.06对照组CP组0.42 ±0.39 1.32 ±0.32 0

3 讨论

慢性牙周炎是以牙周支持组织进行性破坏为特点的多因素疾病，其发病机制比较复杂，除有复杂的牙周微生物发挥作用外，宿主的免疫反应在牙周炎的发生发展过程也起着重要作用。牙周炎的发展过程包括始发期、病变早期、病损确立期、进展期4个阶段，传统观点认为当发展为进行性破坏的进展期阶段时，浸润细胞以B淋巴细胞和浆细胞为主，即Th2细胞介导的体液免疫占主导地位。但近年来又发现了一种新的CD4+T细胞亚型－Thl7细胞，从而为探索牙周炎的发病机制提供了新的思路［7－8］。Th17细胞是一种能特异性高效分泌IL－17的新的细胞亚群，主要受IL－23和转化生长因子 － β(TGF－β)调控［9］。IL－23 属于 IL－12 分子家族，是促进IL－17表达并介导Th17细胞效应的重要细胞因子;同时还能促进CD4+T细胞的增殖，促使T细胞和抗原提呈细胞产生IFN－γ和IL－12，与自身免疫和炎性反应疾病密切相关。IL－23在牙周领域研究备受关注，有学者报道IL－1β可通过激活 NF－κB 和 MAPKs/AP－1 信号转导通路促进牙周膜成纤维细胞产生IL－23，并上调其表达［10］。另有研究发现，种植体周围炎患者的龈沟液及牙龈组织中均有 IL－23存在［11－12］。本课题组在检测Th17相关细胞因子在不同状态牙龈组织中的表达时发现，与健康牙龈相比，慢性牙周炎炎症明显的牙龈组织中IL－17mRNA表达水平显著升高［13］。

本结果显示，慢性牙周炎组和健康组牙龈组织中均有IL－23 mRNA的表达，但在健康牙龈中的表达水平明显低于炎性病变组，提示IL－23在健康牙龈中低水平表达可能与牙周组织正常状态的维持有关，而在牙周炎牙龈组织中，IL－23的表达水平明显升高，说明其对牙周炎的进展也发挥着重要作用。Lester等［14］通过研究健康牙龈位点和慢性牙周炎伴有临床附着丧失位点牙龈中IL－23和IL－17的浓度时发现，IL－23浓度与CAL呈正相关，随着CAL由轻度到中、重度的加重，其表达水平也随之呈显著升高。本实验发现，未经治疗的进展期慢性牙周炎的牙龈组织中，IL－23 mRNA表达明显高于健康对照组，且与GI、PD、AL等牙周临床指标呈正相关关系，表明牙龈组织中IL－23基因水平与局部牙周组织的破坏密切相关，能够反映牙周炎症状态的严重程度。

过去一直运用Th1/Th2理论体系来解释牙周炎的免疫学机制，而近年来关于牙周炎的发病机制又有了新的解释，其主要的突破点在于第三种效应性免疫应答—IL－23/IL－17 通路的阐明［3］。IL－23/IL－17炎症轴在炎症疾病和自身免疫性疾病中均发挥着重要的介导作用，Ohyama等［4］研究显示，IL－23和IL－17在牙周病损中高表达，并由此推断IL－23可能对牙周病的发生发展起非常关键的作用。在牙周炎发病机理中存在IL－23/IL－17炎症轴介导的理论，为进一步研究牙周炎的发病机制及治疗提供了新的理论依据［14］。本研究只是检测了牙龈组织中IL－23基因的表达，而其他Th17相关细胞因子在基因和蛋白水平的表达情况，以及各细胞因子之间的相关性等还需进一步研究。

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The expression of IL－23 mRNA ingingival tissues of patients with chronic periodontitis

ZHANG Xu，SHANGguang－wei，CHEN Fu－bo，FANG Li，YU Fang，
XIE Yun－feng，WEN Hai－yan，TANG Xiao－shan
(Department of Stomatology，Shanghai Tenth People’s Hospital of Tongji University，Shanghai 200072，China)

AIM:To observe the expression of IL－23 mRNA ingingival tissues of chronic periodontitis patients.METHODS:Samples ofgingival biopsies were collected from chronic periodontitis patients(n=23)and periodontally healthy individuals(n=15).The IL－23 mRNA expression was examined by real－time PCR.Before sampling，the clinical periodontal indices were recorded.RESULTS:A significant overexpression of IL－23 wasdetected in periodontaldisease－affected tissues compared to healthygingival tissues(0.0060 ±0.0034 vs 0.0034 ±0.0018，P＜0.05).The level of IL－23 expression in periodontitis tissues was positively correlated withgingival index，probingdepth and attachment level(P ＜0.05).CONCLUSION:IL－23 might play an important role in the pathogenesis of chronic periodontitis.

chronic periodontitis;interleukin－23;real－time quantitative PCR

R780.2

A

1005－2593(2014)01－0030－04

2013－05－19;

2013－11－25

张旭(1976－)，女，汉族，河北人。硕士，主治医师

唐小山，Tel:021－66301726

·流行病学·