医学真菌菌株保藏方法概述

桑军军 邓淑文 郭凯 潘炜华 廖万清

(1.上海长征医院皮肤病与真菌病研究所全军真菌病重点实验室第二军医大学附属长征医院皮肤科，上海 200003;2.上海市医学真菌分子生物学实验室，上海 200003;3.第二军医大学附属长海医院血液科，上海 200433)

1 医学真菌保藏的背景及意义

微生物菌种保藏是一项重要的微生物学基础工作。为此，在国际上一些发达的国家中都设有相应的菌种保藏机构。例如:美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、荷兰的真菌保藏中心 (Centraalbureau voor Schimmelcultures，CBS)、英国的国家典型菌种保藏所 (National CollectionofTypeCultures，NCTC)等。我国也设有多个菌种保藏中心，涉及工业、农业及医学等多个方面。例如中国普通微生物管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)。近10 a来，由于广谱抗菌药、糖皮质激素、细胞毒性药物、免疫抑制剂等药物的广泛应用，以及各种器官移植术、导管介入治疗、放射治疗等多种医疗手段的开展，人为地改变了微生物与宿主之间的关系，造成了患者体内菌群失调，为真菌感染提供了良好的环境［1］。随着老龄化的加快、HIV感染患者增加、恶性肿瘤的发病率增加，真菌感染的易感人群也在增大［2］。各种抗真菌药物的频繁使用，导致真菌菌株的耐药性越来越严重。所以对真菌病流行病学、致病机理、耐药机理以及防治策略的研究尤为重要，而所有研究的基础都建立在对医学真菌的进行有效的保藏。医学真菌的保藏对研究其致病机理、耐药趋势、系统进化都有重要意义。

2 医学真菌保藏的原理及要求

医学真菌保藏的原理同其他微生物的保藏原理相同。通过低温、干燥、隔绝空气等方法，降低真菌的新陈代谢，最大的延长其保藏时间。理论上，只要至少满足其中一个条件，就可以对菌种进行保藏。

医学真菌保藏的要满足3个条件:1)保持菌株的纯度和活性;2)维持形态学、生理学以及致病力的稳定;3)保持基因的完整性，避免菌株变异。

3 医学真菌保藏的方法

目前医学真菌的保藏方法有很多种。主要有定期移植法、液体石蜡法、无菌蒸馏水法、滤纸法、冷冻保藏法、冷冻干燥保藏法等，可以把医学真菌保藏总结为以下几种方法。

3.1 传代培养保藏法

传代培养法是将菌种定期接种到适宜菌株生长的培养基上，然后放入室温或4℃保藏。斜面接种传代保藏法是最常用的方法。它可用于实验室中各类医学真菌的保藏，而且简单易行，且不要求任何特殊的设备。但是此方法易发生培养基干枯、基因突变、菌株污染等现象。在临床工作中，传代培养法需要耗费大量的时间和人力，而临床上收集到的大量病原真菌很难按照其要求进行定期的转接。因此此法适用于少量菌株的短期保藏，不适宜大量菌株的长期保藏。一般酵母菌于4℃保藏，每4～6个月移接1次;丝状真菌 (霉菌)于4℃保藏，每6个月移接1次。

3.2 蒸馏水保藏法

蒸馏水保藏法是将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器密封，于室温或4℃等温度保藏。蒸馏水保藏法对于大部分医学真菌的长期保藏是十分有效的。Fernandez等［3］对102株保藏在蒸馏水中的组织胞浆菌和隐球菌(92%菌株保藏时间＞10 a)进行复苏，荚膜组织胞浆菌、新生隐球菌和格特隐球菌的成活率分别为 64.3%、79.1% 和 100%。Dana［4］在对在蒸馏水中5℃保藏20 a的69株担子菌纲的菌株进行复苏，82.6%的菌株仍然有很强的活力。Bueno等［5］观察了曲霉等26中丝状真菌在蒸馏水中的保藏情况，在2 a内全部都有活性，未发生明显的形态学变化。Andrew等［6］对保藏在蒸馏水中2个月～21 a的179株真菌进行了复苏，其复苏率达到了90%。章强强等对蒸馏水法和冷冻干燥法对78株菌株保藏情况进行评价，12 a后其生存率分别为89.7%和87.2%。结果表明，蒸馏水保藏法是简单、廉价和可靠的保藏方法［7］。但是也有研究显示，菌株在蒸馏水长期保藏其某些性状可能会发生改变，例如形态学和一些酶类的改变。Katia等人对白念珠菌常温蒸馏水保藏和SDA培养基保藏180 d前后进行形态学和酶学的方法鉴定，其形态及酶的产生均有所改变［8］。蒸馏水保藏法长期保藏对菌种形态学、生理学以及基因的影响还有待进一步研究。对于条件有限的基层医院或实验室，蒸馏水保藏法是一个经济有效的长期保藏菌株的方法。

3.3 隔绝空气法

隔绝空气法是将矿物油、甘油、液体石蜡等对菌株生长无害的基质覆盖于培养基上，是菌株浸入基质中以达到隔绝空气的目的。以矿物油保藏法为例，将琼脂斜面或液体培养物浸入灭菌的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1 cm为宜，并以橡皮塞代替封口，竖直放置于室温下或4℃冰箱中保藏。保藏时间延长一般为1～2 a。Manoel等人观察了矿物油保藏对伞枝犁头霉和布氏犁头霉形态学的影响，结果发现矿物油不影响其营养和无性生殖形态［9］。要注意的是，某些菌株能利用石蜡为碳源，还有些菌株对液体石蜡保藏敏感。所有可以利用基质或对基质敏感的菌株应避免用此种方法保藏。此方法简便有效，不需要特殊的设备，不需要经常转种，可用于大部分医学真菌的保藏，特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。但是保存时，需要直立放置，所占空间较大，且不便于携带和转移。

3.4 载体保藏法

载体保藏法是将真菌吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸、有孔玻璃珠、脱水明胶上，而后进行干燥，以保藏菌种［10-11］。此法适用于产孢子或芽孢的微生物的保藏。以沙土保藏法和滤纸保藏法为例。沙土保藏法是将真菌孢子悬液加入灭菌的沙土中，经真空干燥后，于低温或常温保藏，保存期可长达十年。滤纸保藏法是将要要保藏的真菌孢子吸附在灭菌滤纸上，干燥后冷藏。其方法是将滤纸剪成小条，放入干燥的培养皿中灭菌。将培养好的菌种用灭菌脱脂乳或奶粉复原乳制成孢子悬液，用灭菌镊子将准备好的滤纸条在灭菌操作下浸入菌悬液中，取出后放入灭菌小试管中，在真空干燥机上抽干，冷藏。Renata等［12］观察了沙土保藏法对双相真菌的活性、形态学和二态性的影响，发现双相真菌很难在土壤中长期保藏。

3.5 冷冻保藏法

冷冻保藏法是将菌株放入低温保藏的方法，可分为低温冰箱保藏法 (-20℃、-40℃、-80℃)、干冰保藏法(约-70℃)和液氮保藏法 (-196℃)。通过冷冻，将真菌体内水分凝结，从而降低其代谢速度，达到长期保藏的目的。以-80℃冰箱保藏法为例，先离心收获对数生长中后期或稳定期的真菌，用新鲜培养基悬浮后加入等体积的冷冻保护剂，混匀后分装入冷冻管中，以1℃/min控制性降温至-30℃左右，于-80℃超低温冰箱中保藏。很多因素影响保藏菌株的活力、表型及其潜在的基因完整性，它们包括保藏温度、保护剂的种类、保藏前的状态、降温速度、融解速度等［13］。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好，液氮中保藏的菌种的存活率远比其他保藏方法高且回复突变的发生率极低。但是在冷冻的过程中，会出现冻伤的现象。冻伤来源于pH的改变、缓冲液的凝结、溶解的气体、电解质浓度变化、细胞内结晶、菌体收缩等因素。水凝结的物理效应可以破坏细胞膜［14］，低温过程中冰晶的产生可能会给细胞带来致命的伤害。所以在保藏过程中，降温和融解的过程是需要控制的，慢速的降温和快速的融解可以得到较高的复活率。一般认为-1℃/min对大多数医学真菌都是安全的［14］。在菌种复活时，要尽快融解，可以放到菌种正常生长温度的水浴锅里融解。为了保藏的结果更加令人满意，通常在培养物中加入一定的冷冻保护剂，例如甘油、海藻糖、DMSO等。Gujjari等［15］研究了啤酒酵母在4种保护剂 (DMSO、甘油、山梨醇、蔗糖)在2种温度 (-80℃、液氮)下菌株保藏情况。8种不同保藏模式下的菌株分别在5个时间点 (0、6、20、40、55个月)取出。以山梨醇为保护剂在-80℃保藏的菌株在20个月后，活力下降了90%，其余7种模式，都很好的保持了菌株的活力，这说明山梨醇不适合作为啤酒酵母的保护剂，甘油、DMSO、蔗糖都可以作为有效的保护剂。为了验证不同模式对菌种DNA的可能影响，Gujjari观察了一个营养缺陷株在保藏过程中回复突变的比例，结果发现-80℃保藏40个月和55个月后，其回复突变率显著增高，而且突变率与活性的降低呈正相关性变化。液氮保藏则回复突变没有随时间有明显的变化，液氮保藏优于-80℃保藏。不过，冷冻法不适用于某些不耐低温的菌株，如蛙粪霉属以及毛癣菌属的部分真菌 (如Trichophyton concentricum、Trichophyton schoenleinii等)［7，16］不适合低温保藏。

冷冻保藏法，特别是液氮超低温保藏，存活率高，突变率低，保藏时间长，是世界培养物保藏协会(WFCCs)推荐的方法之一，但是其缺点是培养物运输较困难，需要低温冰箱，液氮罐等特殊设备。

3.6 冷冻干燥保藏法

冷冻干燥保存法是使微生物在冷冻状态下，然后在真空减压的情况下利用升华现象除去水份，是微生物在非剧烈，避免细胞直接损伤的情况下处于干燥、缺氧状态，使细胞的新陈代谢减慢，从而达到长期保藏的目的［17］。具体方法为将培养至稳定期的真菌与保护剂 (例如脱脂牛奶)混匀后，取适量加入安瓿管中，在-40℃冰箱预冻2 h，置于冷冻干燥机上冷冻干燥8～20 h，熔封，测定真空度，合格后室温或4℃保藏。在冷冻干燥的过程中为了尽量减少细胞损伤，加入保护剂十分必要，保护剂可分为小分子保护剂(如低聚糖类、醇类、缓冲盐类、氨基酸和维生素类)和大分子保护剂 (如蛋白质、多肽类和多糖类)。作为小分子保护剂，一般具有很强的亲水性，分子结构含有3个以上氢键，在冷冻或干燥过程中，可与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或菌体蛋白质极性基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性。而大分子保护剂通过“包裹”形式保护菌体，同时，促进低分子保护剂发挥作用［18］。保护剂类型的选择主要取决于菌株。目前用的比较多的保护剂包括血清、脱脂牛奶、糖类、甘油、二甲亚砜、谷氨酸钠等。冷冻干燥保藏技术适用于一些产孢子的真菌，特别是一些能够产生子囊孢子和分生孢子的真菌，保藏周期可达到 20 ～ 40 a［19］。Bond［20］介绍了英国国家酵母菌保藏中心(NCYC)的保藏方法，并认为真空冷冻干燥保藏法适用于绝大对数酵母。Tan等［21］介绍了荷兰菌种保藏中心 (CBS)的保藏方法，冷冻干燥保藏法已用于50 000株菌株的保藏。张俊达等［22］观察了常见医学真菌真空冷冻干燥保藏后存活情况。结果显示，皮肤癣菌的存活率达91.6%，酵母样菌总存活率为83.5%，深部真菌总存活率为83.4%，腐生真菌总存活率为75%。但是冷冻干燥保藏法对真菌形态学，生理学以及基因水平的影响有待进一步研究。Cavalcante等［23］用形态学，生物化学和随机扩增的多态性DNA(RAPD)标记的方法对8株冷冻干燥保藏的隐球菌进行了比较，发现其形态，荚膜大小以及RAPD条带均有变化。

冷冻干燥保藏法法是医学真菌菌种长期保藏的最为有效的方法之一，大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10 a之久而不丧失活力，而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输，但操作过程复杂，需要冷冻干燥机等设备条件。

4 总 结

根据世界培养物保藏协会 (WFCCs)的指南，不同的微生物要根据其自身特点选择适宜的保藏方法以保持其最佳活性和纯度。为了最大限度的减少菌种丢失的可能性，每个菌株至少用两种方法保藏，其中至少有一种保藏方法为冷冻干燥保藏或者保藏到液氮中或-140℃的超低温保藏 (http://www.wfcc.info/guidelines/)。与菌株保藏相关的工作也十分重要。每一个要分配一个唯一的编码，用形态学的方法或者ITS测序鉴定到种，尽量包含更多的信息，包括生长曲线、显微照片、代谢资料、基因指纹图谱等。保藏之前必须要检测其纯度，菌株的活力应该在保藏前、保藏中和复活后进行被检测并记录。为了确保没有生理学或基因水平的改变，可以对生长速率、形态学也可以进行代谢和基因水平的评估［17］。

虽然目前超低温保藏法和冷冻干燥保藏法是长期保存微生物菌种的最安全、可靠的方法，但是不同种属的菌种又有其特异性。Crespo等［24］观察了-80℃保藏、冷冻干燥法、蒸馏水保藏法、传代法对马拉色菌保藏的效果，结果发现只有-80℃保藏能成功的复活所有的菌株。Deshmukh［25］对239菌皮肤癣菌通过斜面传代法、蒸馏水悬浮法、矿物油法、二氧化硅干燥法、土壤保藏法以及冷冻干燥保藏法进行了对比，结果说明一些简单的方法如蒸馏水悬浮法，斜面接种法等复活率也达到了令人满意的效果。各个单位和实验室保藏条件也不尽相同，要根据自己的实际选择最科学，经济和有效的保藏方法。

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