抗白念珠菌感染的疫苗及抗体研究进展

张艳霞 阎澜 姜远英

(1.福建中医药大学药学院，福州 350108;2.第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433)

近几年，我国深部真菌感染发病率不断升高，其中白念珠菌引起的感染约占60.7%［1］。白念珠菌是引起皮肤黏膜和系统性真菌感染的常见病原菌。临床缺乏早期念珠菌诊疗手段、可用抗真菌药物种类有限、抗菌谱窄且毒副作用大及耐药性等问题是临床真菌感染难以治疗的主要原因。免疫缺陷患者侵袭性念珠菌感染的死亡率由30%增加到50%［2］。疫苗毒副作用低，具有靶向选择性，因而，开发具有强化机体免疫功能和抗真菌作用的疫苗成为防治白念珠菌感染的有效措施。抗真菌疫苗激活促炎细胞因子Th1或者Th17，并表达共刺激分子，从而指导适应性免疫系统的应答，最终吞噬细胞能够清除真菌细胞，抑制真菌感染;理想抗原能刺激宿主B细胞产生足够水平的特异性保护性抗体。白念珠菌的毒力因子、葡聚糖、甘露糖、热休克蛋白90(Hsp90)、几丁质 (chitin)和烯醇化酶(enolase)等都被用作抗原，可刺激宿主产生保护性抗体，故可作为疫苗研发。以下就目前白念珠菌的疫苗和抗体研究进展作一综述。

1 糖及糖蛋白疫苗

白念珠菌和其他真菌的候选疫苗大多含有糖类成分，如β-葡聚糖、甘露糖。而这些糖类成分先通过结合固有免疫细胞表面受体，激活固有性免疫细胞，再进一步诱导适应性免疫的发生。

β-葡聚糖，是白念珠菌细胞壁中含量最高的多糖。Bromuro等［3］用热灭活白念珠菌和酿酒酵母免疫小鼠，小鼠免疫血清中存在与β-1，3和β-1，6葡聚糖 (GG)反应的抗体。因此 Torosantucci等［4-5］认为葡聚糖组成的疫苗可能更符合临床的需要。为了验证这一设想，他们使用了一种与病原真菌无关的昆布多糖，来源于棕色海藻，有β-葡聚糖的特性，可替代真菌成为免疫原。但是由于昆布多糖本身免疫原性较弱，Torosantucci将蛋白疫苗白喉毒素CRM197与之结合，制备成糖-蛋白结合性疫苗(Lam-CRM)。用Lam-CRM免疫小鼠，结果表明该疫苗对系统性念珠菌感染有很好的免疫保护作用，小鼠存活率在70%以上，感染后肾脏中菌落的富集量显著减少。小鼠血清中产生了抗β-葡聚糖的IgM和IgG型抗体。将此疫苗接种大鼠阴道内，能显著减少阴道内白念珠菌 CFU计数［6-7］。Bromuro等［8］使用油水兼容性佐剂 MF59与Lam-CRM疫苗共同接种小鼠阴道，结果表明该免疫能显著保护小鼠阴道，防治真菌感染。β-葡聚糖是真菌细胞壁必不可少的成分，Rachini等［9-10］于2007年研究结果表明:β-葡聚糖也是抗新生隐球菌和卡氏肺囊虫保护性抗体的作用靶点。此疫苗同时对曲霉也有免疫作用，推测可能对所有细胞壁中含有葡聚糖的真菌都有效。因此，Lam-CRM这种糖-蛋白结合疫苗是一种与病原体种类无关的、较有前景的新型疫苗。

甘露糖，是白念珠菌细胞壁的重要组成成分。甘露聚糖与蛋白质或脂类共价结合，存在于胞壁最外层，由β-1，2连接的甘露糖残基构成的多糖部分与磷脂连接形成磷酸甘露聚糖。在系统性白念珠菌感染过程中，细胞壁表面成分最先与宿主接触，能诱导宿主产生免疫防御反应，其中磷酸甘露糖复合物 (phosphate mannose compound，PMC)是导致该效应的最主要成分之一。但是，PMC被单独作为念珠菌疫苗时，机体的敏感性很低［11］。Polonelli等［12］将脂质体用作PMC的佐剂载体并在系统性念珠菌模型中实验，用脂质体包埋的PMC接种到小鼠体内，被接种的小鼠比对照组小鼠生存时间延长。但脂质体的不稳定性和多重体内注射的必须性阻碍了这种疫苗的临床应用。Han Y等［13］用人工合成的β-1，2-甘露三醇取代 PMC，并以体内表达白念珠菌细胞壁表面蛋白代替小牛血清载体蛋白，这种包括了确定的甘露聚糖表位和体内表达的细胞外载体蛋白的疫苗有潜力诱导一个更强的保护反应，因此提高了疫苗预防念珠菌的潜在效能。

甘露糖蛋白(MP)是白念珠菌细胞壁糖蛋白，是一种重要毒性因子。抗MP单克隆抗体MAbC7和MAbK10具有对抗白念珠菌的作用，可抑制真菌与喉癌上皮细胞的黏附，抑制真菌菌丝生长。Sevilla等［14］2006年的研究表明，MAbC7单独使用可以保护小鼠抵抗系统性念珠菌病。但是MAbC7具体针对的细胞表位目前为止并不明确，推测可能被细胞壁糖基所覆盖。Omaetxebarrfa等［15］认为，白念珠菌表面的烯醇化酶以及核孔蛋白Nup88可能是其识别表位。2011年 Xin H.和 Bren S.等［16-17］的研究已证实MAbC7具有抗念珠菌活性，阻断真菌细胞壁黏附素的表达，抑制白念珠菌黏附于宿主细胞壁，抑制出芽，具有强大的广谱杀菌作用。

2 核糖体疫苗

对于亚单位疫苗的研究，Segal等从1981～1997年对白念珠菌核糖体片段研究最广泛［18-20］。他们通过对白念珠菌胞质的差速离心获得一系列核糖体片段，将其与弗氏不完全佐剂(IFA)作为免疫原，分别免疫3组具有不同免疫力的小鼠:正常免疫功能ICR小鼠组，环磷酰胺预处理过的免疫功能低下小鼠组，Balb/c与C57小鼠杂交有淋巴肿瘤的F1小鼠组，用致死剂量的白念珠菌攻击各组接种疫苗的小鼠，结果显示白念珠菌核糖体片段免疫小鼠能有效控制正常小鼠白念珠菌的感染，对于免疫缺陷小鼠有部分保护作用，即使对有淋巴肿瘤的F1小鼠也有一定的保护性。他的研究提示白念珠菌核糖体片段，对热带念珠菌也有免疫防治作用［19］。因以IFA为佐剂的核糖体疫苗临床效果不佳，Levy等1989年报道［21］应用白念珠菌核糖体片段与肺炎克雷伯菌细胞壁片段的组合疫苗可增强疗效。肺炎克雷伯菌细胞壁片段发挥佐剂的作用，这为白念珠菌核糖体疫苗成为临床候选疫苗开辟了道路。Segal的团队在1997年报道的研究中用脂质体作为佐剂［20］，使用了两种制备技术把核糖体包埋入脂质体中，脂质体不仅充当疫苗的载体，同时也作为一种免疫佐剂。他们发现这种疫苗与普通核糖体疫苗同样具有显著保护效果，而且以脂质体为载体的疫苗可同时诱发细胞和体液免疫。但是核糖体提取物的成分中可能包含mRNA、多肽、残留胞壁、rRNA和核糖体蛋白等，所以核糖体疫苗的免疫原性并不是十分清楚，但Segal等的研究还是显示了这类疫苗潜在的利用价值。

3 Hsp90蛋白疫苗及抗体

白念珠菌热休克蛋白(heat shock proteins)，是能使白念珠菌适应不利的生存环境的一类蛋白。Hsp90是存在于白念珠菌细胞壁与胞质的蛋白质，是很多分子量在90kD附近的热休克蛋白。热休克蛋白作为分子伴侣，可以协助其他蛋白分子折叠，防止蛋白聚集，促进折叠错误的蛋白定向降解。Hsp90广泛表达，并高度保守，占细胞内总蛋白的1% ～2%［22］。

Fukuizumi等［23］从系统性念珠菌感染的患者血清中分离获得Hsp90(相对分子质量90 kD)和它的降解片段 (相对分子质量47 kD)。经检测，92%系统性白念珠菌感染患者和恢复患者均产生了高滴度的针对47 kD分子的抗体。Matthews等［24］对此进一步研究，用系统性念珠菌感染患者血清找出Hsp90 C末端的连续表位C、B和H，表位C，即LKVIRK表位，免疫印迹上与47 kD反应的患者血清均识别表位C。以化学合成的LKVIRK表位与匙孔蓝蛋白偶联物作为免疫原，再用免疫动物获得的抗Hsp90抗体对感染小鼠进行免疫治疗，结果表明抗Hsp90抗体治疗能明显降低系统性念珠菌感染小鼠的死亡率。Matthews等进一步证明:重组rHsp90蛋白疫苗能够诱导感染系统性念珠菌病的实验小鼠产生高水平抗Hsp90的特异性抗体。Wang等［25］研究发现:针对白念珠菌热休克蛋白Hsp90的特殊表位(SE-CA-HSP90)产生的特异性抗体，能够增强迟发性超敏反应、自然杀伤细胞的活性和ConA介导的脾细胞增值，白念珠菌Hsp90的特殊表位(SE-CA-HSP90)可能会成为一个具有潜力的抵抗白念珠菌感染的疫苗。抗白念珠菌热休克蛋白90抗体依芬古单抗(efungumab)是人的重组抗Hsp90的单克隆抗体片段，模拟Hsp90抗体的保护作用，其在与两性霉素B脂质体开展的随机双盲临床研究中，显示出不错的治疗效果;同时依芬古单抗还可协同其他抗真菌药物如卡泊芬净等，用于治疗侵袭性念珠菌病［26］。

4 凝集素家族蛋白疫苗

黏附素是白念珠菌的毒力因子之一，能促进菌体对宿主细胞的黏附。凝集素样 (agglutinin-like sequence，ALS)蛋白家族，是白念珠菌发挥黏附功能的主要蛋白。Als1p(Agglutinin-like sequence 1 protein)属于白念珠菌外源凝集素超家族成员之一，可介导白念珠菌与人体细胞相结合［27］。Spellberg［28］和 Ibrahim 等［29］利用重组 Als1p 氨基端多肽(rAlslp-N)疫苗及重组Als3p(Agglutinin-like sequence 3 protein)氨基端多肽(rAls3p-N)疫苗联合佐剂接种小鼠，对血液播散性念珠菌感染小鼠都有免疫保护作用，且效果相当。但是rAls3p-N对口腔和阴道黏膜局部的念珠菌病防治效果比rAlslp-N更好。rAls1p-N及rAls3p-N均可通过迟发性变态反应发挥免疫保护效应［30］，两者皆有望成为防治播散性和局部念珠菌病的候选蛋白疫苗。

5 活菌疫苗

灭活的全疫苗能使机体产生特异性的细胞和体液免疫，由此人们采用了不同方法制备灭活的菌体疫苗。Fukuizumi等［23］将经福尔马林处理过的灭活白念珠菌接种在家兔扁桃体上，诱导产生了抑制白念珠菌与人口腔上皮细胞黏附的抗体，这为全细胞灭活疫苗预防并治疗口腔念珠菌病提供可能。Bromuro等［3］用二硫苏糖醇和蛋白酶K处理热灭活的酵母态白念珠菌，他们将处理及未处理的灭活细胞分别对感染小鼠进行尾静脉注射，发现注射处理后灭活细胞的小鼠平均存活时间达60 d以上，而注射普通灭活细胞的小鼠平均存活时间为1～3 d。Bromuro等研究中还发现一些抗念珠菌表面抗原的抗体可以阻断免疫血清的自卫能力。所以通过处理去除了细胞表面抗原的灭活细胞疫苗，免疫效果更佳。

目前还有一些减毒的活菌疫苗正被研究。Fernandez等［31］将丝裂原活化蛋白激酶相关基因HOG1敲除的白念珠菌CNC13用于免疫白念珠菌系统性感染小鼠模型，小鼠存活率达60%～70%。Martínez 等［32］用白念珠菌 ECM33(编码白念珠菌细胞壁合成成分)突变株、Saville等［33］用白念珠菌tet-NRG1(参与调节白念珠菌菌丝的生长)突变株作为疫苗，也得到了显著的抗白念珠菌感染的效果。

6 P43疫苗及抗体

白念珠菌P43(促B细胞分裂素)是白念珠菌抵抗宿主防御反应所必需的一种蛋白，该蛋白可以通过与单核/吞噬细胞的相互作用，使白介素10水平升高，从而抑制淋巴细胞清除病原体的能力。Tavares等［34］进行了P43中和抗体消除实验。他们将P43皮下注射小鼠，并在3周后给与免疫加强剂;免疫接种P43后予以腹腔注射白念珠菌，在接种后第7天和15天被念珠菌感染小鼠组中没有发现菌落富集现象，在接种后30 d被感染的小鼠组内，25只中只有1只小鼠有真菌存在;而对照组中，白念珠菌菌落富集现象严重。Tavares等［34］进一步研究用非致死剂量的白念珠菌接种于小鼠体内，30 d后，用致死剂量的白念珠菌攻击，进而将抗P43的抗体 (用非致死剂量的白念珠菌芽孢免疫过30 d后，小鼠血清中提取所得)注射给小鼠，发现小鼠体内白念珠菌菌落富集量明显下降。对于该种疫苗目前还在进一步的研究中。

7 Sap2疫苗及抗体

分泌型天冬氨酸蛋白酶(secreted aspartie proteinase，SAP)是白念珠菌的一种胞外水解酶，被认为是白念珠菌致病机制中重要的毒力因子之一。De Bernardis等［35］研究认为使用SAP蛋白免疫小鼠可以产生抗SAP抗体，该抗体可保护阴道不受念珠菌的感染。在天冬氨酰蛋白酶家族 (Saps)中，Sap2主要与黏膜感染有关，并且在感染后期优先表达。Vilanova等［36］利用Sap2作为抗原进行预防接种，发现皮内注射高度纯化的以明矾为佐剂的天然Sap2蛋白有明显的免疫保护作用。并且可以降低白念珠菌感染小鼠肾脏的菌负荷。Sandini等［37］用重组Sap2的氨基端多肽 (rSap2t)，以霍乱毒素为佐剂免疫大鼠，再用免疫获得的抗rSap2t抗体去免疫阴道感染模型的幼型大鼠，能明显降低实验组大鼠阴道分泌物的载菌量。

8 抗白念珠菌卵黄蛋白抗体

抗白念珠菌卵黄抗体是白念珠菌免疫产蛋母鸡后从鸡蛋中提取的一种卵黄免疫球蛋白(IgY)，它能与白念珠菌特异性结合。Ibrahim等［38］使用免疫抑制的小鼠模型研究抗白念珠菌卵黄蛋白抗体在体内的作用，发现口腔给药可明显降低小鼠口腔白念珠菌的数量。Wang等［39］体外实验，发现抗白念珠菌卵黄蛋白抗体还可以抑制氟康唑耐药或是敏感白念珠菌的生长。这些结果说明抗白念珠菌卵黄蛋白抗体在体内或体外均可抑制白念珠菌的黏附和生长，能有效对抗口腔念珠菌病，并可减少白念珠菌的播散。Fujibayashi等［40］研究发现卵黄蛋白抗体对白念珠菌黏附及生物被膜的生长有明显抑制作用，还可以减少白念珠菌对人口腔上皮细胞的黏附且存在剂量依赖性。鸡卵黄抗体以其制备简便、产量高、成本低、安全性好等优势，有望能较好地应用于防治口腔白念珠菌感染。

9 结 语

迄今为止，只有极少数白念珠菌抗原被生产出来，它们中只有极少数在实验动物模型中被彻底研究过免疫原性和保护性。不同的白念珠菌菌株毒力各不相同。因此，抗白念珠菌的候选疫苗必须考虑到白念珠菌菌株多样性，需要对不同的白念珠菌都能起效。白念珠菌疫苗对于白念珠菌病的预防和治疗都有积极意义。预防性疫苗能有效控制白念珠菌的传播，而治疗性疫苗将会降低白念珠菌感染的死亡率。目前认为治疗白念珠菌感染除了抗真菌药物以外，还需使机体处于高免疫状态。由此，抗白念珠菌感染疫苗的研制显得格外重要，特别是对那些因为抗真菌药物而导致体内正常菌群失调的患者更是如此。前期一些成功的实验以及新的基因工程疫苗、免疫佐剂、细胞因子和给予免疫激活树突状细胞等免疫疗法的出现，将为疫苗的进一步研究，提供更多可能。

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