297例浅部真菌病临床及病原菌菌种分析

张伟铮 陈力 赵瑾 陈江汉

(1.广东省中医院大学城医院检验科，广州 510006;2.上海长征医院皮肤病与真菌病研究所全军真菌病重点实验室第二军医大学附属长征医院皮肤科，上海 200003)

浅部真菌病(Superficial mycosis)是指由致病真菌或条件致病真菌感染人体皮肤、毛发和甲等浅表组织而引起的一组疾病。在我国人群患病率可达20% ～25%，其发病率仍呈逐年增加趋势［1］。临床主要的致病真菌以皮肤癣菌为主，

但近年来其他致病真菌如念珠菌等感染有明显增加［2］。为了解上海长征医院皮肤科门诊浅部真菌病的病原菌菌种构成特点，以便指导治疗，对2013年4月～2013年11月就诊于皮肤科门诊的297例浅部真菌病患者，进行致病真菌菌种分析。

1 资料与方法

1.1 临床资料

对于297例临床诊断为浅部真菌病且真菌直接镜检阳性者 (花斑癣除外)，进一步进行真菌培养及菌种鉴定。诊断标准是:具有典型临床表现，甲屑、皮屑、病发真菌镜检和培养阳性。年龄范围在2～87岁。

1.2 真菌镜检及培养

①取材:取患者的病发、皮屑或甲屑。②真菌镜检:将标本置于载玻片上，加1滴10%KOH，覆盖盖玻片在显微镜下观察，找到菌丝或孢子为阳性。③真菌培养:将病发、皮屑及甲屑接种于含氯霉素 (0.05 g/L)的沙氏培养基 (SDA)，28℃培养2周，隔天取出观察生长情况。

1.3 菌株鉴定

对丝状菌用马铃薯琼脂培养基 (PDA)、尿素琼脂培养基、米饭培养基进一步分离培养，根据菌落形态特征及颜色、菌落生长速度、分生孢子的形态及菌丝特征等进行鉴定;念珠菌转种科玛嘉念珠菌显示培养基和米粉培养基进行鉴定，无法明确菌株使用梅里埃API 20C AUX酵母菌鉴定试剂盒鉴定，操作方法参照试剂说明书。

1.4 分子生物学鉴定

对少见及疑难菌株进行rDNA ITS区间序列测定，确切鉴定菌种。①DNA提取:使用氯化苄(benzyl chloride)法提取基因组DNA，具体操作见参考文献［3］。②PCR扩增:引物分别选用真菌通用 引 物 ITS4、ITS5［4］。 引 物 序 列 为 ITS5:5 ＇-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3 ＇，ITS4:5 ＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇;PCR 扩增体系 25 μL，包括 3 μL 模板 DNA，20 μmol引物各 0.25 μL，dNTPmix 12.5 μL，余体积用水补齐。PCR 条件:94℃预变性 5 min;94℃变性 60 s，55℃退火 60 s，72℃延伸60 s，30个循环;72℃ 10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。③序列测定:PCR产物送上海美吉生物医药科技有限公司进行双向测序。测序结果在 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)数据库中进行比对鉴定菌种。

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件包对数据进行χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床资料分析

297例患者镜检培养均为阳性，男性161例，女性136例，其中甲癣 138例 (46.5%)，男63例，女75例;手足癣68例 (22.9%)，男34例，女34例;体癣60例 (20.2%)，男46例，女 14例;股癣28例 (9.4%)，男18例，女10例;头癣3例(1.0%)，均为女性。其中不同性别的甲癣、体癣的 χ2值分别是 7.60 和 15.28，P＜0.01，差异性具有统计学意义;其余3种疾病不具有统计学意义。不同年龄段的甲癣 χ2值是12.09，P＜0.01，差异性具有统计学意义;其余4种疾病均不具备统计学意义。浅部真菌病不同性别、年龄的具体分布见表1。

2.2 真菌培养及鉴定结果

在分离的297株菌株中，经过形态观察、试剂盒鉴定及ITS基因序列测序，共鉴定出致病菌13种。其中红色毛癣菌86株 (29.0%);须癣毛癣菌68 株 (22.9%);念珠菌属59 株 (19.9%)，其中近平滑念珠菌32株，克柔念珠菌12株，光滑念珠菌7株，白色念珠菌4株，热带念珠菌2株，土生念珠菌1株，季也蒙念珠菌1株;暗色菌属13株 (4.4%)，其中链格孢4株，球孢枝孢2株，枝状枝孢2株、新月弯孢霉1株，同心盾壳霉1株，其余3株无法鉴定到种;曲霉菌属13株 (4.4%)，其中烟曲霉7株，黄曲霉3株，黑曲霉3株;红酵母菌 12株 (4.0%);青霉菌属 9株 (3.0%);毛霉菌9株 (3.0%);犬小孢子菌5株 (1.7%);浅白隐球菌3株 (1.0%);毛孢子菌属2株(0.7%)，真皮毛孢子菌和阿萨希毛孢子菌各1株;絮状表皮癣菌1株 (0.3%);混合感染17株(5.7%)，主要为红色毛癣菌、须癣毛癣菌或念珠菌属与红酵母菌的混合感染。浅部真菌病病种及病原菌具体分布情况见表2。

3 讨 论

浅部真菌病是指皮肤、指甲、趾甲和毛发发生的真菌感染，是临床最常见的真菌病，不同的菌种可引起不同的临床表现［5］。世界范围内浅部真菌病患病率为20% ～25%，并且随着免疫制剂的广泛应用、社会人口老龄化、美容业兴起、家庭豢养宠物风行及诊断检测水平的提高等综合因素，使浅部真菌病的发病率有逐年增加趋势，其病种与病原学特点也存在着地区差别［6］。了解浅部真菌病的特点对临床开展防治具有重要指导意义。

本组研究中，男女患者的总构成比基本相等，这与国内外报道的男性患者明显多于女性患者有所差异［7］，这可能与样本选取的大小及所在的地区不同有关，而体股癣发病男性多于女性，这可能与男性劳动力度强、汗腺及皮脂腺分泌旺盛，易出汗等关系密切;甲癣发病女性多于男性，这可能与女性喜爱美甲及所穿鞋偏紧、透气不足有关。这与一些相关的报道存在差异［5］，这种差异可能与不同的地理、生活环境等因素有关。

表1 浅部真菌病不同性别、年龄分布(n，%)Tab.1 The different gender and age distributions of superficial mycosis

表2 浅部真菌病病种及病原菌分布情况(n，%)Tab.2 The disease category and pathogens of superficial mycosis

本研究还显示同一病种在不同年龄组的发病率不同，浅部真菌病以18～44岁年龄组发病率最高(47.5%)，这可能与青壮年生理功能较旺盛、社会活动频繁、卫生习惯不良及就诊率高有关;另外，该研究还发现中老年真菌感染率所占比率也不少，分别是24.2%和24.6%，这可能与年龄的增长、基础性疾病增加及免疫抑制剂使用导致免疫功能下降，发生真菌感染有关;儿童浅部真菌病的发病率较低 (3.7%)，其中头癣患者仅0.7%，这与其他地区报道不同［2，5，8］，这可能与本地区经济较发达，家长比较注重子女的卫生情况有关。

在本次研究中，真菌镜检培养阳性患者297例，甲癣138例 (46.5%)，其次是手足癣68例(22.9%)，体癣 60 例 (20.2%)，股癣 28 例 (9.4%)，由此可见甲癣是本地区较为常见的浅部真菌病。不同地区浅部真菌病病种存在差异，可能与地域、气候、生活习惯等不同有关［8-9］。从附表可知，真菌检出前三位分别为红色毛癣菌(29.0%)、须癣毛癣菌 (22.9%)和念珠菌属 (19.9%)，念珠菌属相比其他菌种有明显的增加，存在南北差异性，可能跟本地区地处南方，天气炎热潮湿，更利于念珠菌属的生长繁殖，造成皮肤浅部真菌病的发生，是甲癣的主要致病菌 (11.8%)，其中近平滑念珠菌(32株)的比例要远远高于白色念珠菌 (4株)，这与相应的文献报道不一致，具体原因有待进一步研究。本次研究还检出暗色真菌属 (4.4%)、曲霉菌属 (4.4%)、红酵母菌 (4.0%)、青霉菌属 (3.0%)等通常被认为是污染菌的菌种，但本次选择的是涂片及培养均阳性的病例，且症状典型，培养菌种单一，基本可排除污染可能。这些菌种在其他文献中较少提及，当人类皮肤破损或者免疫功能低下时，可导致人体皮肤组织和内脏器官的真菌感染。并且随着器官移植、免疫抑制治疗的广泛使用及实验室诊断技术的提高，这些菌种所致感染的病例报道将日趋增加，浅部真菌病的致病菌种将越来越广泛，不能忽视一些少见真菌如链格孢引起的真菌病，从另一个角度也说明浅部真菌病的致病菌种在不断发生变迁，这可能与生活水平、生活习惯、人口流动及近年来城市居民饲养宠物多，亲动物性皮肤癣菌的感染几率高有关，应不断调查浅部真菌病致病菌种的变迁，为临床上合理用药提供依据。

［1］朱慧兰，肖常青，李振洁，等.201例浅部真菌病及其病原菌分析［J］.中国真菌学杂志，2007，2(3):148-149.

［2］于智明，蔡丽敏，刘会彬，等.173例浅部真菌病性真菌菌种分析［J］.哈尔滨医科大学学报，2010，44(4):406-408.

［3］林福星，王洪凯.丝状真菌分子细胞生物学与实验技术［M］.第1版.北京:科学出版社，2010:28-29.

［4］Leinberger DM，Schumacher U，Autenrieth IB，et al.Development of a DNA microarray for detection and identification of fungal pathogens invoved in invasive mycoses［J］.Clin Microbiol，2005，43:4943-4953.

［5］米拉，帕丽达﹒阿布利孜，刘旭，等.260例浅部真菌病及致病菌种分析［J］.中国微生态杂志，2011，23(7):637-640.

［6］陈春燕，王鹏.宜昌地区浅部真菌病及真菌分析［J］.中华医院感染学杂志，2011，21(8):1702-1703.

［7］王迎林，陆祖萍，项彤，等.宁波地区浅部真菌病3637例致病菌的菌种分析［J］.中国皮肤性病学杂志，2012，26(10):900-901.

［8］吴玲剑，陈彬，李超，等.温州地区8591例浅部真菌病发病及镜检情况分析［J］.中国卫生检验杂志，2012，22(1):116-118.

［9］方静.浅部真菌病228例患儿真菌感染相关因素调查分析［J］.长江大学学报(自然版)，2013，10(6):24-27.