慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗前后体内TFH细胞的动态变化*

黄春燕， 邓 洪△， 朱建芸， 陈禄彪， 谢冬英， 高志良

(1中山大学附属第三医院感染科，广东广州510630;2中山大学热带病防治研究教育部重点实验室，广东广州510080;3广东省肝脏疾病研究重点实验室，广东广州510630)

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是一种 常见的危害公众健康的慢性感染性疾病。CHB的治疗中抗病毒治疗是关键［1］，而目前对于疗效方面缺乏基线及早期的临床预测指标［2］，究其原因可能是造成乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)持续感染的因素十分复杂，涉及病毒本身和宿主免疫状态等多个方面。CHB的发生、发展、转归以及临床预后都与患者的免疫状态相关，体液免疫在机体的抗病毒机制中也发挥了重要作用。2000年研究发现滤泡辅助性 T细胞(follicular helper T cells，TFH)表面特异性标志为CD4+CXCR5+，可分泌白细胞介素21(interleukin-21，IL-21)等多种细胞因子［3］。TFH细胞以及其分泌的IL-21在体液免疫应答中的重要作用。进一步研究发现在免疫激活的CHB患者中外周血CD4+CXCR5+TFH细胞显著升高，CHB的免疫激活可能与TFH细胞有关［4］，而已有大量的临床研究证实处于免疫激活状态的CHB患者抗病毒疗效较佳［5-6］。但TFH细胞及相关细胞因子在CHB抗病毒治疗前后的动态变化尚不清楚。本研究旨在探讨CHB患者抗病毒治疗对TFH细胞数量、功能的影响以及TFH与抗病毒疗效的关系。

材料和方法

1 研究对象

35例CHB患者均来自2012年4月至2013年8月中山大学附属第三医院的门诊病例，年龄在18～41岁之间，抗病毒治疗的适应症符合2010《慢性乙型肝炎防治指南》［1］，乙肝 e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)阳性者，乙肝病毒DNA(hepatitis B virus deoxyribonucleic acid，HBV-DNA)＞2 ×107IU/L，丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)＞2倍正常上限(upper limit of normal，ULN)，干扰素治疗组ALT≤10 ULN，总胆红素(total bilirubin，TBil)＜2 ULN，同时排除合并其它类型肝炎病毒感染、人类免疫缺陷病毒感染、酒精性肝病、未经控制的自身免疫性疾病、失代偿期肝硬化、肿瘤、孕妇和其它重要脏器病变(严重甲亢、心脏病等)。治疗过程规律监测和随访。

2 主要试剂和仪器

BD FACS LSRII型流式细胞仪。荧光标记小鼠抗人单克隆抗体anti-CD3-PE、anti-CD4-PB、anti-CXCR5-Alexa 488、anti-IL-21-Alexa Fluor 647 及同型IgG1(κ isotype)-Alexa Fluor 647、佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、离子霉素(ionomycin)和固定破膜剂＆阻断剂brefeldin A均购自BD;淋巴细胞分离液购自Sigma，胎牛血清购自HyClone，RPMI-1640培养液购自Gibco。

3 方法

3.1 样本收集 采用Ficoll分层液法对外周血血浆及单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)进行分离备用，分别冻存于-80℃低温冰箱和液氮中。

3.2 细胞内染色及流式细胞术检测 步骤简述如下:用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液调整样本PBMC密度为1×109/L，毎样本管加入刺激物(含 BD GolgiPlugTM)2 μL并置于37 ℃、5%CO2孵箱中4 h。收集细胞先加入anti-CD3-PE、anti-CD4-PB和anti-CXCR5-Alexa 488标记的单克隆抗体，于4℃避光静置30 min进行胞外染色，然后用固定破膜剂，根据说明书对细胞进行破膜处理，破膜洗液洗涤2次后加入anti-IL-21-Alexa Fluor 647标记的单克隆抗体及其同型IgG1于4℃ 避光静置30 min进行胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining，ICS)，破膜洗液洗涤2次后，用300 μL的PBS重悬，应用流式细胞检测仪检测细胞，获得的数据用Flow-Jo软件分析。

3.3 生化及病毒学指标 ALT和TBil采用常规生化检测，乙肝两对半采用化学发光法(Roche)，HBVDNA定量采用荧光定量PCR方法(ABI)检测。

4 统计学处理

流式数据采用FlowJo 7.6.2流式分析软件分析，SPSS 13.0软件进行统计分析，用GraphPad Prism 5 Demo统计软件进行数据整理和作图。计量资料采用均数±标准差(mean±SD)描述，两组间非参数比较采用Mann-Whitney U检验，多组间非参数比较采用Kruskal-Wallis检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 患者基本情况

35例CHB患者均来自2012年4月至2013年8月中山大学附属第三医院的门诊病例(表1)，其中聚乙二醇干扰素α-2a治疗21例，替比夫定治疗14例。患者基线HBeAg均为阳性，治疗前(0周)年龄、性别、HBV-DNA和ALT差异均无统计学意义(P＞0.05)，治疗24周中仅有2例发生血清学转换，治疗随访过程中患者未见严重不良反应。

表1 抗病毒治疗过程中病人基本资料Table 1.Clinical characteristics of the study subjects with antiviral therapy(Mean±SD)

2 外周血T淋巴细胞中IL-21主要由TFH细胞分泌

从PBMC中圈出CD3和CD4双阳性细胞，细胞内IL-21的表达主要是 CD3+CD4+T细胞，CD3+CD4-群的细胞(主要是CD8+T细胞)几乎不表达，IL-21在CD4+CXCR5+T细胞中高表达(2.89% ±2.83%)，见图1。

Figure 1.Analysis of IL-21-producing TFHcells by intracellular cytokine staining and flow cytometry.Intracellular IL-21 was produced mainly by CD4+CXCR5+TFHcells.图1 胞内细胞因子染色和流式细胞术检测CD4+CXCR5+T细胞及其胞内IL-21的表达

3 不同抗病毒治疗对TFH细胞和其胞内IL-21的表达水平的影响无明显差异

CHB患者在2种抗病毒治疗24周中，TFH细胞表达水平均有所波动，但不同时点(0周、治疗12周和24周)差异均无统计学意义;TFH细胞分泌IL-21的水平呈下降趋势(但P＞0.05)(图2A、B);TFH细胞的表达水平在替比夫定(n=14)和干扰素(n=21)抗病毒治疗中(0周、12周、24周)，两者之间差异没有统计学意义(图2C、D)。

4 发生病毒学应答(virological response，VR)与病毒学应答不佳(no virological response，NVR)患者TFH细胞及胞内IL-21表达水平的动态变化

VR(定义为48周内HBV-DNA＜1×105IU/L)组和NVR(定义为48周内HBV-DNA＞1×105IU/L)组治疗前HBV-DNA差异无统计学意义(P＞0.05);VR组治疗12周及24周HBV-DNA较NVR组显著下降(P＜0.01)，见图3A。TFH细胞在NVR组呈持续上升趋势(但P＞0.05);VR组治疗前和治疗12周TFH细胞表达水平均显著高于NVR组(分别P＜0.01和P＜0.05)，见图3B。VR组治疗前IL-21表达水平显著高于NVR组(P＜0.05)，见图3C。

讨 论

目前认为免疫发病机制是CHB发病的主要机制。前期我们研究证实细胞免疫在CHB中起着重要作用［7-8］，而近期有研究显示，在慢性病毒性感染的动物模型中IL-21对特异性细胞免疫功能的维持起重要作用［9］。亦有研究提示在CHB患者中替比夫定抗病毒治疗12周血清IL-21可以预测CHB患者的HBeAg血清学转换［10］。因IL-21是TFH细胞分泌的主要效应因子，从而推测TFH细胞在CHB中发挥了一定的免疫调节功能。而我们研究发现CHB患者使用核苷类似物(替比夫定)或干扰素治疗12周及24周后，2组患者TFH细胞水平变化无明显差别，因两者抗病毒机制不同，故我们推测替比夫定和干扰素对CHB患者TFH细胞影响均是间接作用，或者可能是一种伴随现象。进一步研究发现VR组随着抗病毒治疗HBV-DNA持续下降的同时TFH细胞也随之下降，与之相反，NVR组中TFH细胞持续升高，提示抑制病毒复制可能可以部分恢复TFH细胞的水平。

Figure 2.The levels of TFHcells(A，C)and intracellular IL-21(B，D)during antiviral therapy.A，B:overall effects of antiviral therapy(n=35);C，D:respective effects of telbivudine(LDT)and interferon(IFN).Mean±SD.图2 治疗过程中TFH细胞和胞内IL-21的变化

Figure 3.Changes of HBV-DNA(A)，TFHcells(B)and intracellular IL-21(C)in virological response(VR)group(n=22)and no virological response(NVR)group(n=13)in 24 weeks.Mean±SD.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs NVR.图3 24周内HBV-DNA、TFH细胞和胞内IL-21水平在病毒学应答组和病毒学应答不佳组的变化

有文献报道IL-21对于控制病毒持续感染至关重要［9］，在小鼠动物模型中也发现了 IL-21可促进HBV抗原清除［11］。而在本研究中发现VR组TFH细胞在治疗前、治疗12周和24周均高于NVR组，且治疗前VR组IL-21也高于NVR组，提示了治疗前高水平表达的TFH细胞及IL-21将有助于HBV的清除，从而推测TFH细胞通过分泌IL-21促进体液免疫使HBV得到控制，与前面的研究结果一致。近期有研究报道外周血CD4+CXCR5+T细胞通过IL-21使慢性HBV感染患者的e抗原血清转换受益［15］。其机制可能是由于TFH细胞持续表达CXCR5，在CXCR13的趋化下迁移到B细胞滤泡并同时高表达诱导T细胞共刺激分子、Bcl-6(B-cell leukemia/lymphoma 6 protein)和程序性死亡蛋白1，分泌IL-21，执行辅助B细胞的功能［12-15］，并协助激活B细胞，调节体液免疫反应，并进一步增强HBV特异性细胞免疫反应，最终促进HBV的病毒清除。

总之，TFH细胞的表达水平与CHB抗病毒疗效相关，测定患者治疗前TFH细胞及其胞内IL-21的表达水平将有助于治疗时机的选择及疗效预测。

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