免疫组化染色基本方法分析

王晓梅

肇源县人民医院，黑龙江 肇源 166500

免疫组化染色基本方法分析

王晓梅

肇源县人民医院，黑龙江 肇源 166500

免疫组化染色主要原理是用标记的抗体对细胞或组织内的相应的抗原进行定性，定位或定量检测。经过组织化学的呈色反应而呈现醒目的阳性色彩，用显微镜，荧光显微镜或电子显微镜观察。凡是能作为抗原、半抗原的物质，都可用相应的特异性抗体在组织、细胞内应用免疫组化方法可准确的定位。熟练掌握一种免疫组化技术操作方法步骤，则其它的方法和步骤也基本上掌握了。

免疫组化染色；基本方法

免疫组化染色是一种综合性的技术，在现代生物学领域中广泛应用，尤其是医院病理科应用。免疫组化染色对疾病特别是对肿瘤的诊断、鉴别诊断中提供了可靠的诊断依据。

1 免疫组化染色基本方法

免疫组化染色方法繁多，对不同的染色方法的认识和选择，对免疫组化技术的普及提高和长期开展至关重要。以石蜡切片，室温下操作，辣根过氧化物酶（HRP）系统和用DAB显色为例，并根据免疫组化染色步骤将免疫组化染色方法分为以下几种常用的基本方法：

1.1 直接法（酶标法）

将酶标记在特异抗体上，然后用酶标抗体直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物，最后用底物显示剂显色［1］。

1.2 间接法

将酶标记在第二抗体上，先将第一抗体（特异性抗体）与相应的组织抗原结合，形成抗体复合物，再用第二抗体（酶标记的抗体）与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。

1.3 IGS法（免疫金法）

将胶体金颗粒（直径＞20 mm）标记在第二抗体或SPA蛋白上，反应过程同间接法，只是最后不需显色过程，一般要求用高浓度的免疫金溶液，否则在光镜下不易显示出抗原抗体反应部位所呈现的红色。

1.4 IGSS法（免疫金银法）

基本原理是通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化作用，用对苯二酚还原剂将银离子（Ag+）还原成银原子（Ag）被还原的银原子沉积在金颗粒周围形成“银壳”，“银壳”一旦形成，本身亦有催化作用，从而使更多的银离子还原并促使“银壳”越长越大，最终在光镜下看到被放大的抗原位置呈现黑色或黑褐色［2］。还有：SP二步法；PAP法；ABC法；SP法等。

2 具体方法

医院病理科主要目的是用于病理诊断，ABC法和SP法最适于病理诊断应用。

2.1 ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶连结法）

2.2.1 试剂配制 0.01 mol磷酸盐缓冲液（PBS）PH7.2；0.05 molTris-HCl缓冲液（TBS）pH 7.6；3.3%过氧化氢甲醇液；DAB显色液；0.9%NaCl；SP试剂盒配制。

2.1.2 操作方法 石蜡切片脱蜡至蒸馏水。PBS洗5 min/2次。3%过氧化氢甲醇液20 min。（目的是消除内源性过氧化氢酶的活性），蒸馏水洗，PBS浸泡5 min。滴加封闭用血清室温20～30 min。倾去血清，滴加第一抗体，4℃冰箱过夜或37℃温箱孵育60 min。PBS冲洗，5 min/2次。滴加生物素标记二抗，室温1 h或37℃温箱30 min。PBS冲洗，5 min/2次。滴加ABC复合物，室温1 h或37℃温箱30 min。PBS冲洗，5 min/2次。用新鲜配制的DAB-H2O2液显色，5～20 min。自来水充分水洗，蒸馏水洗5～10 s。用淡苏木素液复染细胞核，半分钟左右（Harris苏木素液1份加4份蒸馏水混合即成）。自来水洗5～10 min。（主要目的是蓝化细胞核）80%、95%、无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

2.1.3 结果 阳性反应部位呈棕黄色；细胞核呈淡蓝色。

2.2 SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法）

2.2.1 试剂配制 0.01 mol磷酸盐缓冲液（PBS）PH7.2；2.0.05 molTris-HCl缓冲液（TBS）pH 7.6；3.3%过氧化氢甲醇液；DAB-H2O2液（显色液）；0.9%NaCl；SP试剂盒配制。

2.2.2 操作方法 石蜡切片脱蜡至蒸馏水。PBS冲洗5 min/2次。3%过氧化氢甲醇室温5～10 min（以消除内源性过氧化物酶的活性）。蒸馏水洗，PBS浸泡5 min（如需采用抗原修复或酶消化在此步骤后进行）。每张切片滴加1滴或50 μl封闭用血清，室温10 min。每倾去血清，每张切片滴加1滴或50 μl第一抗体或即用型一抗，4℃冰箱过夜或37℃温箱孵育60 min。PBS冲洗，5 min/2次。每张切片滴加1滴或5 μl生物素标记第二抗体或即用型生物素二抗。室温1 h，或37℃温箱30 min。PBS冲洗，5 min/2次。每张切片滴加1滴或50 μl辣根酶标记链霉卵白素（第三抗体）或即用型三抗工作液。室温1 h或37℃温箱30 min。PBS冲洗，5 min/2次。用新鲜配制的DAB-H2O2液显色5～10 min。自来水充分水洗，蒸馏水洗5～10 s。用淡苏木素复染细胞核，半分钟左右［3］。自来水洗5～10 min。80%、90%，无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

2.2.3 结果 阳性反应部位呈棕黄色；细胞核呈淡蓝色。

3 讨论

免疫组化染色定性，定位或定量检测。最大限度保存组织或细胞内待检物质的抗原性，以保证检出的细胞内超微量的抗原成分。免疫组织化学染色为病理外检中应用最为广泛的技术手段之一。

［1］朱淑玲，杨清绪.免疫组化染色结果分析［J］.中国现代医生，2007，45（16）：120-121.

［2］李捷艳，黄春鑫.免疫组化染色常见问题的探讨［J］.赣南医学院学报，2007，27（1）：131-131.

［3］漆楚波，朱润庆，夏和顺，等.组织芯片简易制作方法及免疫组化有效性分析［J］.肿瘤防治研究，2007，34（8）：629-632.

The Basic Method Analysis of Immunohis to Chemical Staining

WANG Xiaomei People’s Hospital in Zhaoyuan County，Zhaoyuan HeiLongjiang 166500，China

The principle of immunohistochemical staining is to utilize marked antibodies to qualitative，position or quantitative corresponding antigen in cells or tissues.With histochemitry，color reaction shows striking positive colors，which can be observed by microscope，fluorescence microscope or an electron microscope.Any substance that can be used as antigens or haptens is able to be precisely positioned within tissues and cells by immunohistochemical method with the aid of corresponding specific antibodies.Having a good mastery of immunohistochemical technique operation method and procedure，the other methods and procedures are acquired basically.

Immunohistochemical staining，Basic method

R446.6

B

1674-9316（2014）21-0132-02

10.3969/J.ISSN.1674-9316.2014.21.081