标准曲线法测定土霉素片的抗生素效价

2014-01-29乔晓芳杨景秀

中国医药指南 2014年35期

关键词：土霉素培养皿法测定

乔晓芳杨景秀

（1 安阳市食品药品检验所，河南安阳 455000；2 林州市食品药品检验所，河南林州 456550）

卫生部抗生素分册规定用抗生素微生物检定法——管碟法（二剂量法[1]）测定其抗生素微生物活性（效价）[2]，本文利用抗生素微生物检定法标准曲线法[3]测定其效价，效果较好，结果满意。

1 实验方法与结果

1.1 标准曲线制备

1.1.1 中间浓度的选择：根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，在抗生素项下规定的剂量与反应线性范围内选择一个中间浓度C0＝13.5 U/mL。

1.1.2 标准溶液浓度的确定：依照标准品说明书的规定，临用对照药典规定稀释，各剂量按等比级数稀释。剂量间的距离为1∶0.85，算出中间剂量邻近的高低2个浓度，C0+1及C0-1，再分别计算各剂量的浓度，各种浓度Cm（m1~m8）分别为7.0、8.5、9.8、11.5、16.0、18.8、22.0、25.5 U/mL。

1.1.3 标准土霉素溶液的制备：精密称取土霉素标准品，用灭菌水制成1000 U/mL，精密吸取20 mL至200 mL量瓶中，加磷酸缓冲液（pH7.8）稀释成100 U/mL。再分别精密吸取3.5、7.0、8.5、9.8、11.5、16.0、18.8、22.0、25.5 mL至100 mL容量瓶中，用pH6.0的磷酸盐缓冲液稀释至刻度，制成中间浓度为13.5 U/mL及Cm（m1~m8）各种浓度的标准溶液。

1.1.4 标准曲线的制定：取试验用直径约90 mm、高16~17 mm的培养皿24只，分为8组每组3只，每组各培养皿内间隔的3枚不锈钢小管内分别滴满标准品，Cm1~8，即8.4……21.0 U/mL溶液；另3枚不锈钢小管内均滴满标准品的中间浓度C0即13.5 U/mL溶液。在36 ℃培养14~16 h后，用游标卡尺逐一测量每个培养皿3个浓度的抑菌圈直径。分别求得每组3个培养皿中间浓度C0所致的抑菌直径平均值y0即C1~C8所致抑菌圈直径的平均值，ym（即Cm＝1~8）。令fx＝ym-y0，分别计算测得值，则8组培养皿可得出f1~8的8个反应参数（表1）。以fm值为横坐标，以相应的抗生素浓度对数为纵坐标，在方格纸上标点，将各点联结即成标准曲线（图1）；或经计算，得出回归曲线直线方程式：Y＝0.15663X+1.32985，相关系数：r＝0.99878。

表1 土霉素标准曲线实验数据

表2 两法测定样品的结果（n=4）

1.2 供试品效价测定

1.2.1 供试品效价测定：取标准品制备中间浓度的标准液，并取供试品，预估效价后，精取10 mL，加灭菌水制成每1 mL中约含1000 U的溶液，摇匀，静置，精密量取上清液适量，用pH6.0的磷酸盐缓冲液稀释到与标准品的中间浓度相同的供试液。取试验用放置6枚不锈钢小管的培养皿，一般不小于3个，在每一培养皿中，间隔的3枚不锈钢小管中分别滴满中间浓度的标准液，另3枚不锈钢小管中滴满供试液。在36 ℃培养14~16 h后，用游标卡尺测量各抑菌圈的直径。分别求得标准液抑菌圈的直径。分别求得标准液抑菌圈直径平均值y。和供试液抑菌圈直径的平均值ym，算出的差数（fm）。据此在标准曲线上读取供试液的浓度，即可换算成供试品所含效价（U/mL），也可以代入回归曲线直线方程式，算出供试品的效价（即含量）。

1.2.2 供试品效价的试验比较：用标准曲线法测定土霉素片[2]批号分别为20101007、20111104、20120506、20121210，并与抗生素微生物检定法（二剂量法）相比较，结果如下（表2）。

1.3 重复性试验：取土霉素片（批号为20121210），按标准曲线法测定6份，其平均值为98.6%，RSD为1.40%。