男性不育症动物模型的国外研究进展

赵 玉 欧阳斌 耿 强，＊

1.天津中医药大学研究生院（300193）；2.天津中医药大学第一附属医院男科

男性不育症是影响家庭和睦以及社会稳定的全球性问题。据世界卫生组织调查，有将近15%的育龄夫妇存在不孕不育问题，男女双方原因各占50%［1］，而引起男性不育症的主要原因包括物理因素、化学因素、内分泌因素、环境因素、遗传因素等，但是相当一部分患者原因不明，国内外近年来关于男性不育症的基础研究越来越多，相关的动物模型建立发展迅速。本文将近年来有关男性不育症动物模型的研究进展进行综述，为有关男性不育方面的基础及临床研究提供参考。

1 物理因素

1.1 热效应

哺乳动物睾丸的热敏性决定了其需要在适宜的温度下才能发挥正常的生精功能，故大多数雄性动物睾丸的生长位置在腹部及腹部外周。睾丸组织温度低于体温，是精子生成的基本保证。睾丸温度超过所需适宜温度，生精功能将发生改变［2］，故可通过给予睾丸热应激建立生精功能异常的动物模型。

一般能够建立热效应的手段包括水浴加热、激光、红外线等，但是实验中主要采用水浴方法，因为其操作简单、可控性强，不易造成动物其他脏器的损害。Kanter等［3］通过水浴加热兔睾丸建立不育症动物模型，睾丸处在43℃的恒温水浴中30 min后，兔睾丸生精功能异常。通过观察发现高温能够显著降低兔睾丸内谷胱甘肽的含量以及超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性。此外，接触高热能够导致睾丸内脂质过氧化作用增强，继而影响正常精子的生成。Pérez-Crespo等［4］运用同样的方法，将小鼠置于43℃水浴30 min，随后将小鼠附睾内的成熟精子进行回收并观察热暴露后的精子数量、精子活率、运动轨迹、前向运动精子和精子DNA完整性的变化，发现瞬间适度高温能够导致生殖细胞死亡，精子数量及活力降低，且精母细胞对于热暴露有更高的敏感性。

1.2 辐射效应

通过对实验动物生殖器官进行辐射处理，可以得到相应的不育动物模型。辐射处理动物睾丸组织，可使生精细胞及精子DNA链发生断裂，同时生精小管的正常结构发生改变，继而影响生精功能，与此同时，辐射干预加强了促凋亡基因的转录，加速精子死亡［5］。体外X射线（4Gy）辐射或体内植入同位素In-114（1.85MBq）污染的俄歇电子，两种形式的辐射均能造成输精管内精子数目和睾丸重量的显著降低，其中In-114的效果更明显［6］。最新研究发现利用2.45 Hz微波照射20周龄成年小鼠后，其精子数量及活力显著降低，表现为生精小管直径缩短以及曲细精管变性，睾丸内诱导型一氧化氮合酶表达增加［7］。

2 化学因素

2.1 棉酚

棉酚是草棉、树棉或陆地棉成熟种子、根皮中提取的一种多元酚类物质。有研究表明棉酚能够对精子活力以及密度造成影响［8］。口饲粗棉籽油能够使小鼠体内游离棉酚剂量达到14 mg／kg，产生对睾丸的生殖毒性［9］。腹腔内注射剂量为5、10、20 mg／kg的棉酚溶液后，发现大鼠的精子活力及密度显著降低，支持细胞自身毒性加强，加速曲细精管变性，大剂量同时能够影响小鼠肝的正常功能［10］。在造模时应注意棉酚对模型肝功能的损害，选择未观察到不良影响的最佳剂量为宜。

2.2 腺嘌呤

腺嘌呤是通过诱发慢性肝、肾功能损害建立动物模型的常用药物，可造成雄性大鼠睾丸生精功能障碍，因此腺嘌呤大鼠不育症动物模型为当今不育症药效学及药理学研究的常见模型之一。以200mg／kg腺嘌呤灌胃30d，观察发现服用腺嘌呤后大鼠的精子总数及活力显著降低，同时腺嘌呤能够降低血清睾酮含量、抑制类固醇合成及睾丸内皮素-1相关的m RNA表达［11］。但考虑到其具有较强肝肾毒性，应选择造模最佳剂量及时间。

2.3 雷公藤

雷公藤为卫矛科植物雷公藤的根，其提取物雷公藤多苷能够造成小鼠生殖功能损害。按剂量30 mg／kg口饲雷公藤多苷8周后，SD大鼠的精子密度、活力及精子内Ca2＋浓度均显著下降［12］。提示雷公藤提取物长期口饲喂养小鼠能够成功建立动物不育模型。考虑到雷公藤的药物毒性，在利用雷公藤提取物造模时，应选择未损伤其他脏器的最佳剂量及时间。

2.4 乌本苷

乌本苷是在非洲或南美洲植物中发现的一种具有强心作用的甾体化合物，是 Na（＋）／K（＋）-ATP酶（钠泵）的唯一天然抑制剂［13］。研究发现乌本苷能够影响小鼠支持细胞内支持 Na（＋）／K（＋）-ATP酶基因表达的细胞信号传导，剂量为1μM乌本苷干预会引发支持细胞外信号调节激酶和磷脂酰肌醇激酶／丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶磷酸化的增加，与此同时，乌本苷上调了支持细胞周期蛋白D1的表达以及［甲基-（3）H］胸苷的掺入，继而影响支持细胞正常生理功能，造成生精功能异常［14］。

2.5 甲醛

甲醛具有小鼠生殖细胞毒性，能够对小鼠生殖细胞造成损伤。研究表明气体甲醛吸入给药（10 ppm／1h）35d后，小鼠睾丸内睾酮含量、附睾精子浓度以及精子活力显著下降，而精子畸形率升高［15］。最新研究发现，甲醛能够加速小鼠睾丸组织的自噬作用，表现为睾丸重量和组织学改变，睾丸生精功能下降［16］。甲醛具有较强毒性，因此应用甲醛建立模型的稳定性及安全性有待更深层次的研究。

2.6 白消安

白消安主要应用于治疗恶性肿瘤，但长期服用可导致体内沉积，抑制生殖干细胞分化，导致生殖功能异常［17］。研究表明单一腹腔注射剂量为5 mg／kg的白消安，就能够使雄性小鼠生精功能发生异常，主要表现为睾酮分泌水平下降、睾丸体积缩小以及曲细精管结构发生变化［18］。当剂量分别调节到15、30、45 mg／kg时，经过4周白消安干预后，所有剂量组的小鼠生育力丧失，＞95%的精原干细胞在3 d内消失，生育能力以及精原干细胞数量随着时间增加可逐渐恢复，但是在高剂量白消安干预下恢复受到明显抑制［19］。

3 内分泌因素

3.1 己烯雌酚

己烯雌酚是人工合成的雌激素，能产生与天然雌二醇相同的药理作用。研究表明己烯雌酚能够抑制小鼠生殖功能。选择刚出生的幼年雄性小鼠皮下注射100ng己烯雌酚，注射后小鼠睾丸内间质细胞、生殖细胞以及多核细胞减少，同时影响下丘脑功能，导致内分泌功能失调［20］。另有研究发现己烯雌酚能够干扰小异源二聚体伙伴基因Nr0b2的表达，而该基因的表达能通过调节生殖细胞进入减数分裂以及睾酮合成来控制睾丸功能［21］。提示在己烯雌酚干预下能够抑制小鼠睾丸生精，建立不育症模型。

3.2 炔雌醚和左炔诺孕酮

左炔诺孕酮炔雌醚片为常用的有效避孕药，应用广泛。其中主要成分为炔雌醚和左炔诺孕酮，两者均为人工合成的激素类药物。研究证实单独使用炔雌醚或联合应用两者的混合物均会对大鼠生殖功能造成损害，将SD大鼠按重量随机分组，分别口饲0.33 mg／kg炔雌醚和0.67 mg／kg左炔诺孕酮以及同等剂量的两种混合物，小鼠睾丸内表现出畸形精子增多、拉长期精子细胞减少以及粗线期精母细胞分化阻滞［22］。

4 环境因素

环境化合物在日常生活中应用广泛，同时在生活环境中极易接触，其具有较高生殖毒性，因此对于环境化合物的研究已引起学者们的广泛关注，相关研究逐渐增多。

4.1 阿特拉津

阿特拉津的化学名为2-氯-4-二乙胺基-6-异丙胺基-1，3，5-三嗪，属三氮苯类除草剂。研究表明阿特拉津可作为雄性小鼠的一种内分泌干扰物，影响生殖功能［23］。将阿特拉津按照剂量50 mg／kg灌胃后，发现小鼠血清睾酮和睾丸内睾酮含量均明显减少50%；将小鼠体内的间质细胞与232 pg／ml阿特拉津溶液共同培养，间质细胞中睾酮生成减少了35%［24］。近期研究发现，阿特拉津能够降低发育期雄性小鼠睾丸细胞内谷胱甘肽S-转移酶、谷胱甘肽过氧化物酶、氧化氢酶的活性，同时抑制间质细胞的雄核发育［25］。提示阿特拉津具有抑制睾丸生精作用，可作为不育症造模的选择之一。

4.2 甲氧滴滴涕

甲氧滴滴涕的化学名为1，1，1-三氯-2，2-二对甲氧苯基乙烷，属有机氯杀虫剂。口服后能干扰机体自身的激素分泌，导致生殖功能障碍［26］。通过甲氧滴滴涕的活性代谢产物2-（4-羟基苯基）-2-（4-甲氧基苯基）-1，1，1-三氯乙烷和2，2 -二 （4-羟基苯基）-1，1，1-三氯乙烷观察甲氧滴滴涕的生殖毒性作用，结果发现未观察出不良反应的合适剂量为每天0.6mg／kg，此剂量可损害小鼠生殖功能，同时畸形率未发生变化［27］。最新研究发现，在甲氧滴滴涕干预下成年大鼠睾丸早期间质细胞的生成受到抑制，同时随着时间增加血清睾酮含量下降，并且能够抑制新生间质细胞内PDGFB mRNA的表达［28］。

4.3 乙烯菌核利

乙烯菌核利的化学名称为3-（3，5-二氯苯基）-5-乙烯基-5-甲基-2，4-噁唑烷二酮，可作为多种蔬菜水果、植物及草类的杀菌剂。其自身具有抗雄激素样作用，通过与雄激素受体竞争影响正常雄激素分泌，继而抑制睾丸生精功能［29］。将成熟的鲫鱼培育在三种浓度（100、400、800μg／L）的乙烯菌核利溶剂中，发现其所产生的影响程度具有剂量依赖性，而抑制过程主要是通过干扰类固醇的生成降低精子质量［30］。

4.4 双酚A

双酚A的化学名称为2，2-二（4-羟基苯基）丙烷，为已知的具有抗雄激素样化合物，能够诱导雄性大鼠不育［26］。按照剂量为0.0005～5 mg／kg喂养成年大鼠8周，此浓度的双酚A未产生全身毒性反应以及明显的血清激素水平改变，但明显减少曲细精管内上皮细胞的高度和圆细胞的数量以及精子数量，抑制雄激素受体以及精子外部致密纤维蛋白相关基因的表达［31］。另有研究发现，分别用剂量0、20和40μg／（kg·day）的双酚 A干预出生21、35、49d的幼年雄鼠，5周后小鼠睾丸内雌激素受体α表达增加，生殖细胞有丝分裂减慢，精子密度及质量下降，但并不影响生殖细胞印迹基因的甲基化［32］。

5 遗传因素

越来越多的证据表明，许多情况下的男性不育症是由基因缺陷所引起［33］。近年来越来越多有关男性不育症的实验研究围绕该方面展开。通过影响基因表达来建立男性不育症动物模型越来越受到研究者重视。

5.1 磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因敲除

细胞内的磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶（GPx4）能够直接减少过氧化磷脂，具有较强的抗氧化作用。将小鼠睾丸精母细胞内GPx4基因特异性敲除后，雄性小鼠附睾上分离的无GPx4精子无法与卵母细胞在体外结合，表现为前向运动能力下降以及线粒体膜电位降低，继而出现如精子中段发夹样鞭毛弯曲和线粒体膨大等精子异常结构［34］。提示特异性敲除雄性小鼠精子内GPx4后表现为活动力严重下降，同时精子畸形率显著提高。

5.2 雄激素受体基因敲除

雄激素和雄激素受体对睾丸发挥正常功能起着重要的作用，敲除小鼠睾丸细胞的雄激素受体后表现为生殖细胞发育迟缓以及血清睾酮水平降低，继而导致不育。特异性敲除小鼠睾丸管周肌样细胞中雄激素受体基因后，小鼠睾丸呈萎缩状态，生殖细胞总数减少，支持细胞内某些基因不能完全表达［35］。提示特异性敲除小鼠睾丸管周肌样细胞中雄激素受体基因，可使支持细胞功能异常，小管周围细胞收缩力减弱，影响正常精子发生和排出，导致小鼠不育。

6 小结

男性不育症是由多种疾病和（或）因素造成的结果，有高达30%～40%的患者为不明原因［1］，给临床治疗带来了极大的挑战，也推动了众多的临床和基础实验研究。因此相关的造模方法也有很多种，目前主要分为物理因素、化学因素、内分泌因素、环境因素、遗传因素等。使用最广泛的为化学因素，其优势是成功率高、费用低、造模所需时间短，但也存在不足，如应用化学药品可能对肝、肾及其他脏器造成损害，形成多脏器损伤的疾病模型，直接影响模型的生物稳定性。而且部分化学药物的使用剂量在相关文献中不统一，存在重复性差的现状。物理方法对于生殖系统的损伤针对性较强，但生殖功能受到损害后极易恢复，模型稳定性较差，并且干预手段的最佳剂量及时间很难定量。内分泌因素模型给药途径与化学方法相似，但研究数据较少，因此有待更多相关方面的动物实验研究。目前关于环境化合物的基础研究越来越多，大量研究发现许多人工合成并广泛应用于工业及农业的有机化合物均具有较强的生殖毒性，其作用机理与化学因素和内分泌因素相似，但相关研究数据亦较少，考虑到其较强致癌性，剂量、造模时间及给药途径仍有待研究。近年来生精相关基因研究成为生殖医学领域的热点，据报道有超过2300组基因在睾丸中表达，其中有相当多的基因影响人类的生殖功能并能导致男性不育症的发生［36］，因此基因学将成为未来生殖医学领域的研究重点。但基于生精基因造模的操作难度大，尚不能广泛应用于实验研究。综上所述，目前化学方法为主要造模手段，随着研究的深入以及造模方法的不断改进，环境化合物造模以及基因造模或许将代替化学方法，成为未来不育症动物实验的主要造模方法。

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