冬虫夏草无性型发酵技术研究进展

秦 鹏，赵玉卉，王 龙，2 *，路等学

（1.甘肃省科学院 生物研究所，甘肃 兰州 730000；2.甘肃农业大学 草业学院，甘肃 兰州 730070）

过去冬虫夏草一直被认为麦角菌科（Clavicinitaccac）、虫草属（Cordyceps）真菌，拉丁学名为Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.，近几年有关研究从分子生物学角度证实冬虫夏草属线虫草科（Ophiocordycipitaceae）、线虫草属（Ophiocordyceps）真菌，合法名为Ophiocordyceps sinensis（Berk.），野生冬虫夏草为冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾科昆虫幼虫后长出的子座与僵虫体构成的复合体，其具有抗肿瘤、抗病毒等功效[1]。目前，只有中国、布丹、尼泊尔和印度四个国家存在野生资源[2]，而其他国家分布野生冬虫夏草的报道所指为非野生型资源[3]，我国的野生资源仅分布于青藏高原3 000～5 000 m的草甸中且野生资源日益减少。故冬虫夏草有性型研究一直以来是国内外研究的热点[4]且是难点和空白点，虽通过人工模拟培养可获得较满意的僵虫率，但都没有进入有性阶段[5]。随发酵技术的日趋成熟，冬虫夏草发酵技术已成为其资源开发利用的重要途径[6]，不同冬虫夏草无性型作为发酵原料，为发酵技术的评价带来了困难。研究主要就冬虫夏草无性型相关类群展开，以目前综述较少的中国被毛孢及其同种异名和同物异名菌种为原料，对固体、液体发酵技术研究现状展开综述。

1 冬虫夏草无性型

虫草菌是虫草属真菌的统称[7]，目前，全球记载虫草菌的有500多种[8]，中国记载的虫草有120种[9]。杨涛等[1]从冬虫夏草分离出冬虫夏草无性型菌株且经反复培养得到了与野生冬虫夏草完相同的子囊孢子，此后在专利NO.85101971（1985）中命名为冬虫夏草头孢菌（Cephalosporium dongchongxiacae）；刘锡琎等[10]从四川采集了大量冬虫夏草并分离出相同菌株，首次命名并证实中国被毛孢（Hirsutella sinensis）是冬虫夏草的无性型；印象初等[11]将冬虫夏草头孢菌（Cephalosporium dongchongxiacae）重新命名为中华束丝孢（Synnematium sinense）；张显耻等[12]用冬虫夏草头孢菌（Cephalosporium dongchongxiacae）进行液体发酵试验，将该菌定名为蝙蝠蛾多毛孢（Hirsutella hepiali）。显然，冬虫夏草头孢菌（Cephalosporium dongchong xiacae）、中华束丝孢（Synnematium sinense）和蝙蝠蛾多（被）毛孢（Hirsutella hepiali）属同物异名。此外，研究人员分离获得其他冬虫夏草新种，如中国拟青霉（Paecilomyces sinensis）、蝙蝠蛾被孢霉（Mortierella hepialid）、蝙蝠娥拟青霉（Paecilomyces hepialid）等。但是，除中国被毛孢和中华束丝孢（即冬虫夏草头孢或蝙蝠蛾多毛孢）以外，其他新种均与冬虫夏草全DNA相似率差别较大[13-17]，而且根据国际植物命名法则的条款、原则和优先率，只有中国被毛孢和中华束丝孢为合格名，中国被毛孢和中华束丝孢属同种异名[18]，国际公认的冬虫夏草无性型为只有中国被毛孢（Hirsutella sinensis）。目前，虽然冬虫夏草无性型的种类很多，“一名称对应一真菌”将成为以后真菌命名的趋势[19]，但发酵原料的不同会给发酵条件带来很大的影响，以中国被毛孢或其同种异名或同物异名菌种作为发酵原料对发酵技术予以综述。

2 固体发酵技术

固体发酵具有成本低、环保、过程易控等特点。固体发酵研究主要以菌丝体生物量为指标，李春如等[20]以菌丝长势为指标，确定最佳氮源为奶粉＞黄豆粉＞酵母粉＞麸皮，碳源对菌丝生长影响较小，适宜碳源为葡萄糖、蔗糖以及果糖，30%接种量对菌丝生长有显著的影响，CMC和玻璃珠能限制菌丝生长；张安宁等[21]以生长面积和生长情况为标准筛选出最佳氮源为脱脂奶粉、蛋白胨、酵母膏，最佳碳源为蔗糖、葡萄糖；周宇爝等[22]以中国被毛孢的菌丝体生物量为指标，发现氮源对菌丝体生物量的影响从大到小依次为：黄粉虫蛹粉、牛肉蛋白胨、黄粉虫粉，蛋白胨、大豆效果最差，故中国被毛孢优先选择与蝙蝠蛾幼虫相似的动物性蛋白。

以功能成分为指标的研究相对较少，葛飞等[23]以中国被毛孢总核苷类物质为指标，最佳营养需求为酵母浸出粉3%、KH2PO40.2%、奶粉1%、葡萄糖2%、MgSO4·7H2O 0.1%，可显著提高总核苷类物质的含量，此后，葛飞等[24]以中国被毛孢为原料，以麦角甾醇含量为指标筛选出最佳培养基：玉米粉2 g、大米5 g、蚕蛹粉1 g、麸皮2 g，料层厚度2 cm且无光照、培养温度为20 ℃、料水比1∶1.5。

综上所述，冬虫夏草的固体发酵技术报道较少，碳源对菌丝体生物量的影响较小，碳源用葡萄糖、玉米粉、大米和麸皮，氮源对菌丝体生物量的影响较大，动物性氮源优于植物性氮源，而且添加蝙蝠蛾科幼虫相似的动物性氮源效果最好，发酵温度为20～25 ℃且无光照、适宜无机盐添加量有利于菌丝体生长，料水比各有差异，但均趋向于料水比为1∶1.5。虽然冬虫夏草菌固体发酵技术取得了好的进展，但研究大多以菌丝体生物量为指标考察发酵参数，以冬虫夏草菌功能成分为指标的研究很少，有研究者从废弃的蛹虫草大米培养基中提取得到虫草素并进行了纯化工艺的研究[25]，为冬虫夏草固体发酵产有效成分的开发利用开辟了新的途径，而目前没有利用中国被毛孢侵染蝙蝠蛾科幼虫获得功能成分的研究，亦希望相关研究能在这一方面取得突破。

3 液体发酵技术

液体发酵具有生产周期短、发酵产物易于开发利用、发酵参数易于控制、生产效率高等优点。而以菌丝体生物量为指标的液体发酵多，功能成分为指标的研究很少。

以冬虫夏草头孢菌为原料的液体发酵较多。钟士清等[26]以冬虫夏草头孢菌改良菌株A10为原料，以菌丝体生物量为指标，优化发酵条件：葡萄糖4%、酵母粉1%、MgSO4·7H2O 0.05%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%，发酵温度为26～28 ℃，pH 5.0～7.0，接种量为5%，菌丝体对溶氧量要求不高，试验中转速为200 r/min；陈济琛等[27]以冬虫夏草头孢菌为原料，在1%葡萄糖中分别加入2%玉米粉、2%麸皮、20%马铃薯，以2%米糠为空白对照，pH6.0～7.0，含有2%麸皮培养基中菌丝体生物量最大；杨淑全等[28]配制4种液体培养基，以菌丝体干质量为指标，于25 ℃、120 r/min条件下培养9 d后测菌丝体干质量，确定D组比其他组的菌丝体干质量显著增加，D组培养基组分为葡萄糖2.5%、玉米浆0.5%、酵母粉0.5%、蛋白胨0.7%、CaCO30.15%、KH2PO40.15%、pH自然；赵润等[29]以冬虫夏草菌为原料，发酵温度为24 ℃，发酵192 h后测菌丝体干质量，筛选出优化培养基为蔗糖1.25%、葡萄糖1.25%、酵母粉0.0625%、蛋白胨0.02%、KH2PO40.025%、MgSO4·7H2O 0.0125%、VB10.0025%、pH自然；吴彩琴等[30]以菌丝体干质量为指标，筛选出最佳发酵条件为温度26 ℃、接种量5%、发酵时间为4 d、溶氧条件为1 L/min。

以中国被毛孢为原料的液体发酵研究较少。王祖华等[31]以青海采集的冬虫夏草菌索提取得到的冬虫夏草菌为原料，经形态学鉴定为中国被毛孢，在20 ℃发酵192 h测干质量，筛选出最佳发酵条件为蔗糖7.5%、葡萄糖7.5%、酵母粉0.375%、蛋白胨0.12%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.075%、VB10.015%、pH自然；刘欣等[32]从青海野生冬虫夏草中分离得到冬虫夏草菌，经中科院微生物所鉴定为中国被毛孢，以菌丝体干质量为指标，在18 ℃、120 r/min、pH6.8条件下，筛选出最佳培养基组分：葡萄糖2.71%、牛肉水60%、蛋白胨20%、KH2PO40.23%，氮源和碳源均对菌丝体生物量有正效应，氮源含量＞60%，KH2PO4对菌丝体生物量为负效应，应适当添加，效应大小依次为：牛肉水＞蛋白胨＞葡萄糖；DONG C H等[33-34]发现培养基中有蔗糖、维生素B、锌、钙及碳氮比12∶1条件下最有利于菌丝体生长，培养温度为15～18 ℃，超过25 ℃便停止生长。

综上所述，氮源和碳源对菌丝体生物量都有正效应，氮源的影响大于碳源的影响，适宜碳源为葡萄糖和其他碳源的复合碳源，氮源为酵母粉和蛋白胨复合氮源，锌、钙、VB1能促进菌丝体生长，KH2PO4对菌丝体生物量有负效应，应适宜添加，液体发酵温度为20～28 ℃，仅少数研究报道15～18 ℃且＞25 ℃停止生长、＞30 ℃菌株死亡，转速为120～150 r/min，发酵pH值为5.0～7.0。提高虫草素含量的方法较多，除了改善发酵条件外，添加虫草素合成的前体物及其协同氨基酸[35-36]、激发子等可显著提高虫草素产率[37]。而在有性型人工培育方面，蛹虫草全世界分布广泛且可人工大范围栽培，冬虫夏草人工栽培尚未成功，两者功能成分的差异决定人工栽培的成功与否是需要明确的关键问题之一。曲鸿雁等[38]利用冬虫夏草和蛹虫草融合子进行了发酵试验，从该研究可拓展冬虫夏草有性型人工培育的新思路，是否可利用中国被毛孢和灭活的蛹虫草菌复合体以补充中国被毛孢功能成分，进行冬虫夏草有性型人工培养测试。

4 展望

（1）冬虫夏草发酵技术的评价指标体系尚不成熟，以菌丝体干质量或发酵产物中单一有效成分作为评价指标，无法全面系统的评价发酵技术，而且以不同菌株为发酵原料，筛选出的最佳发酵条件会有很大差异，因此，冬虫夏草发酵技术的评价指标体系有待进一步完善。

（2）在有效成分开发利用方面，液体发酵有着诸多优势，对核苷类、甾醇、蛋白类等有效成分的开发利用有很大的帮助，冬虫夏草菌液体发酵产有效成分的研究成为其资源开发利用的趋势，而蛹虫草菌有望取代冬虫夏草菌，成为更可靠、高效的产有效成分的液体发酵原料。

（3）虽然发酵技术作为冬虫夏草资源开发利用的有效途径，但期望有关研究能取得重大突破，人工培育出冬虫夏草有性型。

[1]杨 涛，董彩虹.虫草素的研究开发现状与思考[J].菌物学报，2011，30（2）：180-190.

[2]WINKLER D.Yartsa Gunbu (Cordyceps sinensis) and the fungal commodification of Tibet's rural economy[J].Econ Bot,2008,62(3):291-305.

[3]ZHANG W M,ZHANG Y J,LIU X Z,et al.What is the Chinese caterpillar fungusOphiocordyceps sinensis(Ophiocordycipitaceae)?[J].Mycology,2010,1(4):228-236.

[4]张永杰.冬虫夏草菌的生物学研究[M].北京：科学出版社，2012.

[5]田向荣.冬虫夏草无性繁殖研究及其产物对HepG2 细胞凋亡的影响[D].北京：中国农业大学博士论文，2013.

[6]劳景辉，闫文娟，方佳茂，等.冬虫夏草发酵技术的研究进展[J].中国食用菌，2012（6）：5-7.

[7]ZHANG Y J，LI E W，WANG C S，et al.Ophiocordyceps sinensis,the flagship fungus of China:terminology,life strategy and ecology[J].Mycology,2012,3(3):2-10.

[8]张 姝，张永杰，SHRESTHA B，等.冬虫夏草菌和蛹虫草菌的研究现状、问题及展望[J].菌物学报，2013，32（4）：577-597.

[9]梁宗琦.中国真菌志[M].北京：中国科技出版社，2007.

[10]刘锡琎，郭英兰，俞永信，等.冬虫夏草菌无性阶段的分离和鉴定[J].真菌学报，1989，8（1）：35-40.

[11]印象初，沈南英.冬虫夏草菌Cordyceps sinensis（Berk.）sacc.的无性世代——中华束丝孢Synnematium sinenseYin，Shen sp.Nov.[M].北京：科技出版社，1990.

[12]张显耻，何道珍.中国冬虫夏草菌液体发酵工艺初探[J].食用菌，1995（6）：5-6.

[13]章卫民，李泰辉，陈月琴，等.西藏冬虫夏草无性型的分子生物学研究[J].微生物学通报，2002，29（3）：54-58.

[14]蒋 毅，姚一建.虫草属分子系统学研究现状[J].菌物研究，2004，2（1）：58-67.

[15]李增智，黄 勃，李春如，等.确证冬虫夏草无性型的分子生物学证据I.中国被毛孢与冬虫夏草之间的关系[J].菌物系统，2000（1）：60-64.

[16]赵 锦，王 宁，陈月琴，等.冬虫夏草无性型的分子鉴别[J].中山大学学报：自然科学版，1999，38（1）：123-125.

[17]王 宁，陈月琴，章卫民，等.虫草属多元起源的分子生物学证据[J].中山大学学报：自然科学版，2000，39（4）：70-73.

[18]魏鑫丽，印象初，郭英兰，等.冬虫夏草及其相关类群的分子系统学分析[J].菌物学报，2006，25（2）：192-202.

[19]TAYLOR J W.One Fungus=One Name:DNA and fungalnomenclature twenty years after PCR[J].IMA Fungus,2011,2(2):113-120.

[20]李春如，彭 凡，樊美珍，等.中国被毛孢RCEF0273 培养工艺的研究[J].安徽农业大学学报，2004，31（4）：460-465.

[21]张安宁，袁书林，孙林超，等.4 种虫草真菌生长适宜碳、氮源的研究[J].江苏农业科学，2011，39（6）：404-406.

[22]周宇爝，江明艳，姜福星，等.不同氮源对中国被毛孢生长的影响[J].广东农业科学，2013，40（18）：22-24.

[23]葛 飞，李春如，胡丰林，等.不同培养条件对中国被毛孢胞内核苷类组分的影响[J].菌物学报，2007，26（2）：234-242.

[24]葛 飞，桂 琳，李春如，等.冬虫夏草无性型—中国被毛孢固态发酵条件的初步研究[J].生物学杂志，2009（3）：22-25.

[25]韦会平，叶小利，张华英，等.从废弃蛹虫草大米培养基中高效提取纯化虫草素工艺条件研究[J].菌物学报，2009，28（2）：220-225.

[26]钟士清，胡文锋，罗国威，等.冬虫夏草头孢菌菌丝体液体发酵条件研究[J].华南农业大学学报，1995（3）：108-111.

[27]陈济琛，林新坚，郑 力，等.冬虫夏草头孢菌液体培养和氨基酸测定[J].福建农业科技，1998（6）：18-19.

[28]杨淑全，王澄澈.冬虫夏草液体培养初报[J].中国食用菌，1999（5）：28-29.

[29]赵 润，郭成金.冬虫夏草菌丝体液体培养基的优化[J].天津师范大学学报：自然科学版，2008，28（1）：8-11.

[30]吴彩琴，陈 野，郝 迎.冬虫夏草液体发酵生产多糖和菌丝体的研究[J].食品科学，2009（5）：171-174.

[31]王祖华，张 柯，李永程.冬虫夏草菌种的制备及液体培养基的优化研究[J].洛阳理工学院学报：自然科学版，2010，20（4）：10-12.

[32]刘 欣，张宗豪，徐海峰，等.冬虫夏草菌液体发酵培养基的优化研究[J].食用菌，2013，32（1）：14-16.

[33]DONG C H,YAO Y J.Nutritional requirements of mycelial growth ofCordyceps sinensisin submerged culture[J].J Appl Microbiol,2005,99(3):483-492.

[34]DONG C H,YAO Y J.On the reliability of fungal materials used in studies onOphiocordyceps sinensis[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2010,38(8):1027-1035.

[35]文庭池，雷帮星，康冀川，等.添加前体促进蛹虫草发酵生产菌丝体和虫草菌素的研究[J].食品与发酵工业，2009，35（8）：49-53.

[36]文庭池，康冀川，雷帮星，等.前体及营养物提高蛹虫草虫草菌素产量的研究[J].食品科学，2010，31（5）：175-179.

[37]刘小莉，周剑忠，黄开红，等.古银杏内生真菌的分离及其抑菌活性[J].微生物学通报，2009，36（10）：1513-1518.

[38]曲鸿雁，郭成金.冬虫夏草与蛹虫草融合子菌丝体液体培养基筛选[J].中国酿造，2013，32（3）：106-109.