原花青素HPLC测定方法研究进展

格日勒，亓 伟 *，刘淑娟

（1.银川能源学院 石油化工学院，宁夏 银川 750105；2.宁夏唐明制药有限公司，宁夏 银川 750011）

原花青素（procyanidins，PC）是植物王国中广泛存在的一大类多酚化合物的总称。起初统归于缩合鞣质或黄烷醇类。随着分离鉴定技术的提高和对此类物质的深入研究与深刻认识，现已成为一大类物质并称之为原花青素。原花青素是由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成。最简单的原花青素是儿茶素或表儿茶素或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体，此外还有三聚体、四聚体等直至十聚体。按聚合度的大小，通常将二～四聚体称为低聚体（oligomers procyanidolic，OPC），将五聚体以上的称为高聚体（polymers procyanidolic，PPC）。

葡萄原花青素具有优异的抗氧化性能和显著的清除自由基能力，具有抗心血管疾病、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、抗炎、抗疲劳、改善视觉功能等药理作用[1]。研究表明，原花青素的聚合度决定了其抗氧化活性的大小，对于聚合体来说，聚合度越高其抗氧化性越低[2]。从原花青素的分子结构来看，随着聚合度（分子质量）的增加，分子极性降低。

由于原花青素组成的复杂性，要测定每一组分含量相对困难，因此，关于原花青素的测定方法至今还没有一个统一的标准。在很长一段时间内主要采用的是紫外分光光度法[3]，香草醛-盐酸法[4]、铁盐催化比色法[5]、正丁醇-盐酸法[6]、高铁盐-铁氰化钾比色法[7]等。高锰酸钾分光光度法[8]等。马亚军等[9]建立了硫酸高铈铵分光光度法测定葡萄籽提取物中原花青素的方法，它是通过测定黄色高铈盐的吸光度值，间接测定原花青素。这些方法各有优缺点，检测成本也相对较低，但普便存在专属性，准确度较低，灵敏度不够理想，不能对某一特定的成分进行测定等问题。

高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）是色谱法的一个重要分支，它的出现虽然不长，但这种分离分析技术的发展却十分迅猛，应用十分广泛，该方法已成为化学、医学、工业、农业、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。由于高效液相色谱法的高选择性，使得人们近年来开始研究用此法对葡萄籽（不仅仅是葡萄籽）原花青素进行测定。

从高效液相色谱法（HPLC）及其与其他方法的联用等各种检测方法的基本原理入手，对各种方法的研究领域进行总结。

1 HPLC法

HPLC法具有出色的分离和定量分析性能，其梯度洗脱功能及多种检测器，尤其是紫外和阵列二极管检测器，非常适合对酚类物质进行分析和检测。从早期直到现在的HPLC法中，有很多较成功的实例，对葡萄籽、松树、苹果、山楂、草莓、桦树等一系列植物提取物中原花青素（PC）进行了广泛的研究，一般使用相应的单体和PC成分纯品为外标，建立对各色谱峰逐一定量的分析方法。从原则上说这种方法较分光光度法只用一种参比物测定PC总含量的方法更加精密，结果的准确性较高。

冯建光等[10]根据原花青素聚合度越高，分子极性越小，在C18色谱柱上就吸附的越牢固，用流动相进行洗脱的时候则出峰的时间相对比较晚的原理。用HPLC法对葡萄籽提取物的OPC进行了定量检测，为生产葡萄籽提取物的厂家提供了一个测定方法。杨大进等[11]用HPLC法测定了保健食品中原花青素进行含量测定。赵平等[12]采用AB-8型大孔吸附树脂对原花青素进行分级纯化，再采用高压梯度洗脱的方法对原花青素进行测定。陈召桂等[13]同时用HPLC的指纹图谱对葡萄籽提取物进行定性，并测定葡萄籽提取物中标志性成分原花青素B2的含量，弥补了其他方法不能对葡萄籽提取物做定性分析的不足，从而准确判断葡萄籽提取的质量优劣。

2 高效液相色谱-质谱法

高效液相色谱-质谱法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）是通过样品前处理得到原花青素粗提物，再利用高效液相色谱-质谱进行定性定量分析的方法。如将样品在酸性条件下加热水解，使原花青素C-C 键断裂生成游离的花青素，再用高效液相色谱-质谱进行分析花青素成分，从而对样品中原花青素物质进行定性、定量检测。杨成对等[14]用HPLC-MS法对葡萄籽粗提物中的低聚原花青素的组成作了初步分析。对照原青花素结构，可以推测提取物的主要组分有6种为原花青素成分，分别为两种单体（M=290）、两种二聚体（M=578）、一种三聚体（M=866）和一种二聚单酯。

快速高分离度液相色谱（rapid resolution liquid chromatography，RRLC）与传统HPLC相比，能耐受更高的压力，可达60 MPa，分离度提高60%，速度提高20倍；最小延迟体积配置（120 μL）使其成为LC/MS在窄径色谱柱应用方面的最佳支持，苏叶萍等[15]采用快速高分离度液相色谱-串联质谱（RRLC-MS/MS）法分离分析葡萄籽提取物中原花青素的成分。葡萄籽提取液经HPD400A大孔吸附树脂纯化后，采用RRLC-MS/MS 法分离，并根据质谱信息分析其化学成分，分离检测出葡萄籽提取物中原花青素的3种单体，初步分离鉴定出9种二聚体、5种三聚体和1种四聚体，收到了较好的分离效果。

孙芸等[16]用反相高效液相色谱-电喷雾质谱（reversed phase-high performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrum，RP-HPLC/ESI-MS）法分析葡萄籽粗提物中低聚原花青素的组成。方法根据质谱的准分子离子EM-HI（m/z）检测其单体及低聚体。结果初步检测出3个单体、7个二聚体及3个三聚体。但由于各聚合体异构体数目繁多，其ESI质谱行为也很相近。除单体外，还未能对各异构体的结构进行准确的鉴定。

电喷雾质谱（ESI-MS）可以提供化合物的结构信息，可与液相色谱联用，作为一种软电离技术，可以根据产生的准分子离子直接定性。任其龙等[17]建立了采用液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用（liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrum，LC/ESI-MS）对葡萄籽提取物中的多种低聚原花青素进行分析鉴定的方法。在电喷雾电离负离子模式下采用选择离子监测模式（selective ion monitoring，SIM）将几种低聚体进行了选择性的分离。结果所检葡萄籽提取物中共含有（＋）-儿茶素、（－）-表儿茶素和（－）-表儿茶素没食子酸酯3种单体、8种非酯型和4种没食子酸酯型共12种二聚体及4种非酯型三聚体等。

3 TLC-HPLC/MS法

薄层层析-高效液相色谱-质谱（thin layer chromatography-high performance liquid chromatography/mass spectrometry，TLC-HPLC/MS）法是通过薄层层析法处理得到原花青素粗提物，再利用高效液相色谱-质谱进行定性定量分析的方法。薄层层析法保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点，同时展开速率快，混合物易分离，分辨力较强，根据原花青素各组分极性不同，对原花青素进行测定。可以得到不同聚合度的原花青素。吕丽爽等[18]采用乙酸乙酯萃取原花青素提取液，再用薄层层析法将不同的聚合度原花青素展开，展开剂为甲苯∶丙酮∶乙酸=3∶3∶1，得到3种组分，并通过HPLC及质谱鉴定为单体、二聚体及三聚体。

4 Folin-Ciocalteau法与HPLC结合

在碱性溶液中酚类化合物包括原花青素可以将钨钼酸还原（W6+变为W5+），生成蓝色化合物，颜色的深浅与酚的含量相关，在760nm波长处有最大吸收。此法测定的是试样中总酚的含量，原花青素、低分子多酚、简单酚、带酚羟基的氨基酸及蛋白质和VC等易被氧化的物质均被测出，此法称为福林酚（Folin-Ciocalteau，FC）试剂法，是在福林酚试剂中加入锂盐，克服福林酚试剂不稳定的缺陷，较之更为灵敏，吸收峰也较窄，对酚的选择性较高[19]。

由于按Folin-Ciocalteau 法测定的总多酚是以相当于没食子酸表示的，所以葡萄籽提取物中儿茶素等单体按Folin-Ciocalteau法测定，并以没食子酸的量表示时，不能反应其真实含量。这样造成了按Folin-Ciocalteau法测定总多酚时反应出的葡萄籽提取物中的单体含量与HPLC 法测定的单体含量是存在差异的。因此葡萄籽提取物中原花青素的含量用总多酚的含量减出其中单体的含量必须有一个校正系数。这样才能使Folin-Ciocalteau法和HPLC测定单体含量等同起来[20]。冯建光等[21]用高效液相色谱和Folin-Ciocalteau相结合的方法分析了葡萄籽提取物中原花青素的百分含量，并消除了蛋白质、氨基酸对结果测定产生的影响。

5 香草醛-盐酸/硫酸法与HPLC结合

在原花青素测定法中，香草醛-盐酸/硫酸法是较常用方法，其测定原理是原花青素在酸性条件下，A环的化学活性较高，其上的间苯二酚或间苯三酚与香草醛发生缩合，产物在浓酸作用下形成有色的正碳离子，用分光光度法测其吸光度值，根据标准曲线来计算样品中原花青素的含量，盐酸和硫酸都可作为反应过程的催化剂[22]，该法主要测定的是黄烷-3-醇单体与原花青素的总量，测定步骤简单，方法有着较高的精密度及准确度。向阳等[23]用香草醛盐酸比色法测定葡萄皮和籽中的原花青素，其方法相对可靠。但是，香草醛法操作方式较多、差别比较大[24-26]，不利于使用者的选择。郑俊霞等[27]通过香草醛比色与HPLC法相结合，原花青素含量以黄烷-3-醇、原花青素总量减去HPLC法测定的黄烷-3-醇单体含量之差来代表，针对葡萄籽超微粉中主要成分进行了测定。

6 Porter-HPLC结合法

Porter 法又被称为铁盐催化比色法，该方法具有较好的重现性和准确性。Porter-HPLC法是先将样品用Porter 法进行处理，再进行HPLC分析的方法。原花青素易溶于水，将原花青素的单体或聚合体在加热的酸性条件下经铁盐催化，使C-C 键断裂生成深红色花青素离子后，用HPLC 进行分析，根据保留时间进行定性分析，根据外标法进行定量分析[28]。Porter-HPLC结合法优点在于使用HPLC法对花青素进行测定，从而除去供试液中共存的其他有色杂质的干扰，提高了方法的准确度。

7 硫解-HPLC结合法

苄硫醇可以与原花青素发生专一性的硫解反应，使其分子的基部生成一个黄烷醇分子，而上部的其余单元全部生成黄烷醇的4-苄硫醚衍生物，经这种硫解处理之后再进行HPLC分析，色谱图变得十分简单，通过测定和统计有限几个色谱峰的面积即可计算原来样品中原花青素成分的含量[29]。侯栋等[30]采用硫解-HPLC结合法快速检测原花青素，研究纯化了苄硫醚-表儿茶素和苄硫醚-表儿茶素没食子酸酯，并与没食子酸、儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯为对照品，在一定的色谱条件下，6 种硫解产物可在11 min 之内完成分离，外标法定量分析相对标准偏差均＜1.86%（n=5），最低检出限为0.5～1.5 ng，线性关系良好（r≥0.999 6），平均回收率77.8%～94.6%，该方法具有良好的灵敏度、精密度和准确度。

8 小结

原花青素资源丰富，历经30多年的研究、开发，由于其优越的抗氧化活性，其在改善微循环、治疗眼科疾病、药物与化妆品等领域的应用均取得重大进展，近年来在很多国家都发展迅速，也预示了原花青素的广阔发展前景。虽然研究原花青素的方法很多，但至今还没有一个统一检测方法对其进行定性、定量分析。

HPLC技术对原花青素组分进行分析鉴定有助于探索不同资源的原花青素的组分、结构及功能的关系，形成相关的评价体系，有力地推动原花青素的开发利用，高效液相色谱法及与其他方法的联用可以同时对原花青素进行分离与分析，在原花青素的检测上将发挥越来越重要的作用。

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