铁皮石斛多糖对高糖状态下视网膜Müller 细胞活力及凋亡的调控

李雅嘉 王 华 李强翔

(中南大学湘雅医院眼科，湖南 长沙 410008)

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病严重的微血管并发症之一，分为非增殖性DR和增殖性DR〔1,2〕。Müller细胞是一种特化的神经胶质细胞，具有维持视网膜正常结构、营养视网膜等多种生理功能并参与多种病理过程，如参与增殖性玻璃体视网膜病变的发生〔3〕。目前多数研究证实，Müller细胞不仅起着支持和营养神经元的作用，还包括维持细胞外离子的稳定及参与谷氨酸盐循环、突触传递等作用，甚至对视觉信号的初级整合和处理也有重要的影响〔4〕。视网膜Müller细胞病变在DR进展中可能起着重要作用。因此，预防Müller细胞在糖尿病中的损伤应成为今后研究DR的重点。本文前期研究已发现，铁皮石斛增强免疫抗衰老，全面修复血管、神经、代谢、免疫等系统病变，对糖尿病及血管并发症有一定的防治效果〔5〕。本文通过观察铁皮石斛多糖(PDC)对高糖状态下大鼠视网膜Müller细胞活力及凋亡的影响，探讨PDC对糖尿病视网膜损伤是否有保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 PriCells大鼠视网膜müller细胞(武汉原生原代生物医药科技有限公司提供)；细胞凋亡试剂盒(碧云天生物技术研究所)；PDC，本研究组制备；低糖型DMEM培养液(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；D-葡萄糖和胰蛋白酶粉末(美国Sigma公司)；CO2培养箱(武汉华海公司)；倒置生物显微镜(OLYMPUS 公司)；YXQ-LS-50SⅡ数显立式蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；LDZX-40C型立式自控电热压力蒸汽灭菌器(北京六一仪器厂)；KH-600DB型数据超声波清洁器(美国 JB/TEK 公司)；BD FACS Calibur流式细胞仪(美国BECTON DICKINSON公司)。

1.2高糖模型建立及实验分组 Müller细胞经培养及传代，待细胞达80%融合时弃掉含血清的培养液，换无血清的培养液培养24 h后，再换成含不同浓度葡萄糖的培养液，分别为5、10、15、20、25、30、35、40 mmol/L，通过12、24、36、48、72 h观察后，确立Müller细胞高糖模型的最适糖浓度为25 mmol/L。实验分组：(1)对照组(C组)；用10% 胎牛血清的RPMI1640培养基培养Müller细胞48 h；(2)高糖组(HG组)：用25 mmol/L葡萄糖处理Müller细胞48 h；(3～5)不同剂量PDC组(PDC组)：用100、200和400 μg/ml PDC处理Müller细胞48 h；(6～8)高糖+不同剂量PDC组(HG + PDC)：用25 mmol/L葡萄糖和100、200、400 μg/ml PDC共同处理Müller细胞48 h。

1.3四氮唑蓝比色(MTT)法检测细胞活力。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡率 单细胞悬液接种于6孔板，约5×105个/孔，每孔培养基2 ml，培养12～16 h细胞贴壁后更换高糖全培养基及分别加入PDC共培养48 h。(1)移除培养液，1倍磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次；(2)用不含乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶消化细胞20～30 s，轻轻吹打后移至离心管；(3)800 r/min离心5 min，1倍PBS管内洗涤2遍；(4)分别加入200 μl的Binding Buffer吹打均匀，各组再依次加入5 μl Annexin V-FITC、5 μl propidiumIodide(阴性对照组除外)，混匀后移至专用流式细胞术EP管中；(5)室温避光反应15 min；(6)在488 nm激发波长，525 nm发射波长的条件下，流式细胞仪检测每管细胞的绿光及红光荧光强度(MFI)，以此检测各组细胞凋亡率。

2 结 果

2.1高糖和PDC对Müller 细胞活力的影响 与对照组(0.85±0.05)比较，高糖组Müller 细胞活力(0.41±0.02)显著降低(P<0.05)；而相同浓度的甘露醇组(1.10±0.09)与对照组比较细胞活力没有显著性差异(P>0.05)；铁皮石斛(100、200、400 μg/ml)组的细胞活力(0.89±0.06、1.01±0.07、0.95±0.05)与对照组比较没有显著性差异(均P>0.05)。与高糖组比较，高糖+铁皮石斛(100、200和400 μg/ml)组细胞活力(0.59±0.06、0.79±0.04、0.96±011)均显著增加，呈现浓度依赖性(均P<0.05)。

2.2高糖和PDC对Müller 细胞凋亡的影响 高糖组Müller 细胞凋亡率〔(44.94±7.01)%〕与对照组〔(6.09±0.59)%〕比较显著增加(P<0.05)；而相同浓度的甘露醇组〔(7.20±0.69)%〕与对照组比较细胞凋亡率没有显著性差异(P>0.05)。铁皮石斛(100、200、400 μg/ml)组的细胞凋亡率〔(7.01±0.58)、(7.79±0.97)、(7.57±0.92)%〕与对照组比较没有显著性差异(均P>0.05)。高糖+铁皮石斛(100、200、400 μg/ml)组〔(32.46±5.01)、(19.21±4.12)、(9.35±0.91)%〕与高糖组比较，铁皮石斛以浓度依赖的方式降低了高糖诱导的细胞凋亡(均P<0.05)。

3 讨 论

DR是糖尿病引起的微血管病变，可造成视功能下降及视力丧失。DR是四大主要致盲疾病之一〔6〕。DR的发病机制至今尚未完全清楚，近年来许多国内外学者认为，Müller细胞和神经元一神经纤维相互关系的改变是早期DR视网膜功能异常的特点，Müller细胞在DR发生和发展中起重要的作用〔7〕。Müller细胞是哺乳动物视网膜主要神经胶质细胞，该细胞从内界膜延伸到外界膜，贯穿于整个视网膜，最易受病理因素的影响。在DR的发病过程中，一个最重要的因素就是高糖。Müller长时间暴露于高糖环境中，细胞的超微结构发生变化，细胞器受损导致细胞功能减退〔8〕。对DR的研究多采用动物模型进行体内实验研究〔9〕，而在体外细胞水平研究不多，因此，利用体外培养视网膜Müller细胞是研究增殖性视网膜病变的最佳途径之一。建立视网膜Müller细胞体外高糖模型，在体外模拟体内DM微环境，排除体内其他因素的干扰，在DM病程的发生发展过程中更加直接观察细胞的变化，这些是体内动物实验不能代替的。

凋亡是多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动性死亡过程。研究发现，细胞凋亡失常(过度或不足)参与许多疾病的发生与发展。DR的发病是多因素、多阶段作用的结果，细胞凋亡在DR早期发挥重要终用。Müller细胞不仅参与视网膜的发育过程，而且还在维持细胞结构，营养神经元、清除毒性物质，保护神经元、胞膜表达离子通道与受体，发挥生物学效应、表达白血病抑制因子，保护光感受器、保持视网膜完整和正常的生理功能等方面起到了重要的作用〔10〕。正由于视网膜Müller细胞在维持视网膜结构和功能上的重要性，研究Müller细胞在高糖的影响下其活力及凋亡的变化，对进一步了解DR的发病机制具有重要的意义。有研究表明，在高糖环境下，石斛类多糖具有对多种细胞的保护和修复作用，不仅可以抵抗钙超载，不仅可以抑制胰岛细胞凋亡和坏死、保护胰岛细胞，而且对高糖诱导的血管内皮细胞核转录因子(NF)-κB的过量表达有较好的抑制作用，对糖尿病血管病变有保护作用〔11，12〕。

本研究表明，PDC可能通过提高Müller细胞活性，减少Müller的凋亡，达到保护高糖状态下视网膜损伤的作用。

4 参考文献

1Robinson R，Barathi VA，Chaurasia SS，etal.Update on animal models of diabetic retinopathy：from molecular approaches to mice and higher mammals〔J〕.Dis Model Mech，2012；5(4)：444-56.

2Zhang W，Liu H，A1-Shabrawey M，etal.Inflammation and diabetic retinal microvascular complications〔J〕.J Cardiovasc Dis Res，20l1；2(2)：96-103.

3陈秀丽，过贵元.糖尿病视网膜Müller细胞的研究进展〔J〕.中国体视学与图像分析，2007；12(2)：152-3.

4凌志红，徐格致，龚红华，等.糖尿病视网膜Müller细胞病理改变的体内外研究〔J〕.眼科研究，2005；23(3)：262-5.

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6Xin H，Zhou F，Liu T,etal.Icariin ameliorates streptozotocin induced diabetic retinopathy in vitro and in vivo〔J〕.Int J Mol Sci，2012；13(1)：866-78.

7张亚洁，许红霞，曾凯宏，等.牛磺酸对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞凋亡的防护研究〔J〕.第三军医大学学报，2007;29(12)：1193-6.

8卫 煊，杨建国，陈国辉.ERG 振荡电位作为增殖型糖尿病视网膜病变预兆的探讨〔J〕.眼底病，1991;7(2)：153-4.

9李冬梅，楚洪波，马洪喜.低剂量硝酸镧对糖尿病大鼠血清中过氧化物酶体增殖物激活受体-γ 和葡萄糖转运蛋白4 蛋白表达的影响〔J〕.环境与健康杂志，2013;30(10)：872-4.

10Ozawa Y，Kurihara T，Sasaki M，etal.Neural degeneration in the retina of the streptozotocin-induced type 1 diabetes model.〔J〕.Exp Diabetes Res，2011;2011：108328.

11陈泳荪，刘文洪.铁皮石斛多糖提取工艺及其对高糖诱导血管内皮细胞NF-κB 表达干预的研究〔J〕.山西中医学院院报，2011;12(2)：27-31.

12屠国昌.铁皮石斛的化学成分、药理作用和临床应用〔J〕.海峡药学，2010;22(2)：70-1.