黑灵芝多糖对S-180荷瘤小鼠的免疫调节作用

黄建琴，聂少平，张莘莘，黄丹菲，李文娟，谢明勇

（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330047）

灵芝（Ganoderma lucidum）是我国最具有研究价值的著名药用真菌之一，同时也是一种新资源食品［1］。灵芝多糖被认为是灵芝中最有效的生物活性成分之一，研究证实具有很强的生物活性［2］。大量研究表明，灵芝的滋补强身、扶正固本之功效与灵芝多糖的免疫增强活性密切相关［3］。

目前，国内外大量研究表明，灵芝多糖具有明显的免疫调节活性，特别是在灵芝多糖发挥抗肿瘤的研究中，同时伴随着宿主免疫功能的增强，但其具体作用机制尚未完全清楚［4］。在本项目组前期研究基础上，本实验拟通过建立S-180荷瘤小鼠模型，继而收集荷瘤小鼠中免疫细胞，通过给予不同剂量的黑灵芝多糖（PSG-1），研究PSG-1对荷瘤小鼠免疫细胞的免疫调节作用，初步探讨黑灵芝多糖的抗肿瘤机制。

1 材料与方法

1.1 材料 黑灵芝多糖由本实验室制备，纯度大于99.8%。BALB／c清洁级小鼠，♀，体质量（22±2）g，购自南昌大学医学院动物房。S-180细胞株购自中科院上海细胞库。

1.2 方法

1.2.1 动物的分组及造模 取30只小鼠用于建立荷瘤小鼠模型，8只小鼠作为正常对照组。用PBS将S-180细胞悬液浓度调节至每毫升1×106个，每只0.2 m l接种于小鼠右肢腹股沟处。静养约1周后，小鼠右肢处出现肿瘤块，造模成功。

1.2.2 腹腔巨噬细胞及脾细胞的分离纯化 正常小鼠及S-180荷瘤小鼠颈椎脱臼处死，放入碘伏3 min，75%酒精中浸泡3 min脱碘，腹腔注入5 ml预冷的PBS缓冲液，用棉球轻柔腹部1～2 min后，吸取腹腔液于离心管中，重复洗3次，收集以上PBS。无菌分离小鼠脾脏，在200目的细胞筛上碾磨，PBS冲洗3次，收集以上PBS。再分别以1 000 r·min－1离心5 min，弃上清，收集细胞。

参照前期研究［5］，在细胞中加入PSG-1使其终浓度为20、40、80、160 mg·L－1，另设模型、正常及阳性对照组（LPS，终浓度10 mg·L－1），每组设5个复孔。置二氧化碳培养箱培养24 h。

1.2.3 中性红吞噬试验 腹腔巨噬细胞培养24 h后，弃去培养液，以PBS洗涤，加入1 g·L－1的中性红生理盐水溶液，继续培养4 h。倾去上清液，用PBS洗3遍，每孔加入细胞裂解液（乙醇∶冰醋酸 ＝1∶1）100μl，室温下放置2～3 h，待细胞溶解后，在酶标仪上测定540 nm处吸光度。

1.2.4 巨噬细胞NO生成的测定 巨噬细胞培养24 h后，离心，取上清液，采用硝酸还原酶法测定上清液中NO含量，具体操作方法按照相应的试剂盒说明进行。

1.2.5 细胞上清液中 TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量的测定

细胞培养24 h后，离心，取上清液，采用夹心ELISA法测定 TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量，具体操作方法按照相应的试剂盒说明进行。

1.3 统计学分析 测定结果数据均用表示，采用SPSS 11.70统计软件对实验结果进行单因素方差分析。

2 结果

2．1 PSG-1对巨噬细胞吞噬功能的影响 荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力明显低于正常小鼠巨噬细胞的吞噬能力，以不同浓度PSG-1作用24 h后，与未经任何处理的荷瘤小鼠组相比，荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬能力有明显的提高，高剂量组（＞40 mg·L－1）与正常空白组相比无明显差异，高剂量组间差异无显著性。

2．2 PSG-1对巨噬细胞产生NO的影响 荷瘤小鼠巨噬细胞产生NO量明显低于正常小鼠巨噬细胞所产生的NO含量，但用PSG-1刺激后发现，荷瘤小鼠产生NO的量明显增加，160 mg·L－1剂量组与正常空白组相比无差异，高剂量组间无差异。

2．3 PSG-1对巨噬细胞分泌 TNF-α、IL-1β的影响 实验发现，荷瘤小鼠巨噬细胞的IL-1β分泌量高于正常小鼠的IL-1β分泌量，给予PSG-1后细胞因子分泌量增加更加明显，呈剂量依赖关系；而荷瘤小鼠巨噬细胞分泌TNF-α量低于正常小鼠分泌TNF-α量，但PSG-1处理后，荷瘤小鼠来源的巨噬细胞中细胞因子的分泌量明显增加并高于正常水平。

2．4 PSG-1对脾淋巴细胞分泌IL-6、IFN-γ的影响 实验发现，荷瘤小鼠脾淋巴细胞分泌IL-6量与正常小鼠无明显差异，PSG-1刺激后分泌量明显增加；而荷瘤小鼠高于正常小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ量，同时PSG-1刺激会使其明显增加。

3 讨论

灵芝能防止肿瘤的发生和抑制肿瘤生长，许杜娟等［6］建立肉瘤S-180、肝癌HepA及Lewis腹水癌小鼠模型，观察不同浓度灵芝抗肿瘤作用，结果表明，灵芝能有效增加小鼠抑瘤率和生存率。黑灵芝作为灵芝种属的重要成员之一，由于其免疫调节作用和抗肿瘤作用已经引起越来越多关注，但是其活性成分探讨及作用机制却是直到最近才开始研究的。

在相关研究表明PSG-1具有体内抗肿瘤作用的基础上［7］，本实验通过接种S-180于小鼠右腹股沟处建立荷瘤小鼠模型，无菌分离荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞及脾淋巴细胞用于体外实验。结果显示，PSG-1在体外可以明显提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO、IL-1β和TNF-α的能力，同时提高脾淋巴细胞分泌IL-6、IFN-γ，从而达到提高荷瘤小鼠免疫功能的作用。这些结果进一步表明，PSG-1通过体外作用于荷瘤小鼠免疫细胞，增强其免疫功能，实现抗肿瘤的作用。本实验也用于初步构建多糖抗肿瘤免疫机制研究体系，进一步为其他天然产物活性多糖的抗肿瘤活性机制研究提供理论依据，从而更有效地寻找具有低副作用且高效的抗肿瘤药物。

参考文献：

［1］ 陈志杰，顾振新.灵芝主要活性物质及液体深层发酵技术研究进展［J］.食品研究与开发，2008，29（3）：186－90.

［1］ Chen Z J，Gu Z X.Progress studies on themain active substances and submerged fermention technology of Ganoderma lucidum［J］.Food Res Devel，2008，29（3）：186－90.

［2］ 邓海林，吴佩颖，王建新.灵芝的研究进展［J］.时珍国医药，2005，16（2）：141－3.

［2］ Deng H L，Wu P P，Wang JX.Research progress of Ganoderma lucidum［J］.Lishizhen Med Mat Res，2005，16（2）：141－3.

［3］ 刘福君，赵修南.地黄低聚糖增强小鼠免疫功能的作用［J］.中国药理学通报，1998，14（1）：90.

［3］ Liu F J，Zhao X N.Rehmannia glutinosa oligosaccharides enhance the immune function inmice［J］.Chin Pharmacol Bull，1998，14（1）：90

［4］ Nie SP，Zhang H，LiW J，etal.Current developmentof polysaccharides from Ganoderma：Isolation，structure and bioactivities［J］.Bioac Carbohy Diet Firb，2013，1（1）：10－20.

［5］ 张莘莘，李文娟，聂少平，等.黑灵芝多糖对体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响［J］.中国药理学通报，2010，26（9）：1139－42.

［5］ Zhang SS，LiW J，Nie SP，et al.The effect of polysaccharides from Ganoderma atrum on function of peritoneal macrophagein vitro［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26（9）：1139－42.

［6］ 许杜娟，陈敏珠.灵芝胶囊抗肿瘤作用研究［J］.安徽医药，2003，7（4）：243－5.

［6］ Xu D J，Chen M Z.Study on antitumor activity of Ganoderma lucidum［J］.Anhui Med Pharm J，2003，7（4）：243－5.

［7］ Zhang SS，Nie SP，Huang D F，et al.Immunomodulatory effect of Ganoderma atrum polysaccharide on CT26 tumor bearing mice［J］.Food Chem，2013，136（3-4）：1213－9.