结核分枝杆菌与宿主作用相关蛋白研究进展

李瑞芳 ,管志玉 ,付玉荣 ,伊正君

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)，是第二大致死性感染性疾病的病原体。近年来，由于全球艾滋病的流行、人口流动性的增加、耐多药菌株的出现，全球结核病疫情进一步的加重，导致全球每年约170万人死于结核杆菌感染[1]。在我国，根据第4次结核病流行病学抽样调查数据显示，中国约有近一半人口感染结核分枝杆菌，其中活动性结核病病人数量高居世界第二，已被世界卫生组织列为全球22个结核病高负担和特别警示的高耐药国家之一，形势不容乐观[2]。

结核分枝杆菌是胞内感染菌[3]，呼吸道感染为主要感染途径，在感染宿主后机体会调动自身免疫防御系统来抵御外来病原体，其中巨噬细胞在防御方面起重要作用，是结核分枝杆菌入侵宿主后侵入的首要细胞(肺泡中80%～90% 是巨噬细胞)。首先，结核分枝杆菌侵入巨噬细胞后，巨噬细胞可递呈抗原给T淋巴细胞使其致敏释放淋巴因子，释放的淋巴因子反过来又激活巨噬细胞，使巨噬细胞的吞噬作用加强，巨噬细胞通过吞噬体的成熟和酸化、自噬溶酶体的形成等机制杀灭胞内病原体。其次，VD通过抗菌肽、Toll样受体(TLRs)介导的信号介导自噬也会抑制结核分枝杆菌[4-5]。另外，巨噬细胞和树突状细胞被感染后会引起宿主一系列信号反应导致感染的细胞凋亡，而近几年研究证明，凋亡被认为是抑制胞内结核分枝杆菌繁殖的一种重要机制。面对如此强大的防御系统，结核分枝杆菌作为一个胞内病原体，如何潜伏在宿主体内存活数十年，并且在宿主与病原体之间达到平衡，和宿主保持一种“共生”关系，对这个复杂的现象已经在几年前展开研究。研究证明，结核分枝杆菌多年来之所以成为第二大致死性疾病的病原体，与其能够调节宿主的免疫机制、逃避宿主的免疫防御有关。蛋白质作为生命活动的直接承担者，其研究已成为结核病研究的重要领域。在这里，本文就MTB与宿主之间的相互关系所涉及的蛋白研究进展作一综述。

1 阻止吞噬溶酶体的形成和酸化、抑制自噬的形成以维持结核分枝杆菌生存的蛋白

结核分枝杆菌感染巨噬细胞后通过阻挡吞噬体成熟、酸化和抑制自噬溶酶体的形成在未成熟吞噬体内长期存在[5-8]。结核分枝杆菌作为胞内病原体，长期存在于巨噬细胞未成熟吞噬体，很大程度上归功于其通过抑制V-ATPases的补充[7]等阻止吞噬体成熟使其存留在巨噬细胞内。吞噬体成熟停止的必要性对于维持结核分枝杆菌在巨噬细胞内的生长现在已基本得到了肯定。结核杆菌的一些蛋白和脂类都能抑制吞噬体的成熟而且也是感染后致病力的关键成分。先前已有报道说结核分枝杆菌很多分泌蛋白，如LpdC、NdkA、PknG、PtpA、SapM等，都影响吞噬体成熟，它们会通过不同的路径来发挥其抑制吞噬体成熟的功能从而维持分枝杆菌在巨噬细胞内的生长。蛋白SecA2和PtpA抑制吞噬体成熟的功能都与V-ATPase有关[6，9]，而V-ATPase能使空泡酸化，并且使吞噬体成熟。与结核分枝杆菌毒力关系很大的SecA2蛋白的分泌是V-ATPase的抑制者，抑制V-ATPase的产生从而阻止吞噬体成熟。SecA2也可能参与脂类的生成，而一些表面脂类也参与阻止吞噬体成熟[6]。作为磷酸化酶的PtpA，与V-ATPase H亚基直接连接，并能使吞噬体-溶酶体融合需要的巨噬细胞蛋白VPS33B去磷酸化，阻断V-ATPase运输到含结核分枝杆菌吞噬体, 导致结核分枝杆菌吞噬体酸化受到抑制[9]。磷酸化酶PtpA的连接位置和磷酸化活性位置不同，其中任何一个缺陷虽然不影响另一个功能的发挥，但是不能抑制吞噬体酸化。但同为磷酸化酶的SapM发挥其磷酸化作用是使PI(3)P磷酸化使吞噬成熟抑制。抑制吞噬体酸化和成熟，有些蛋白可单独完成此功能，如磷酸化酶PtpA，而也有些需要依赖于其它成分。有研究说，M. Marinum 的Mh3881c、CFP-10 和ESAT-6的分泌是需要互相依赖的，而且这种依赖性对于分枝杆菌在巨噬细胞内的生长是必须的，对于抑制吞噬体的成熟也是必须的。作为Mh3881c的同源蛋白结核分枝杆菌的Rv3881c与Mh3881c可能有同样的功能。

分枝杆菌会通过分泌某些细菌蛋白，改变自身成分和调节宿主细胞信号通路抑制吞噬体和溶酶体的融合。“提高胞内存活”蛋白Eis通过JNK通路对抗自噬[10-12]。Kim KH 等[10]指出，结核分枝杆菌 Eis是一个乙酰基转移酶，能迅速乙酰化JNK特异性磷酸酶，通过对偶-特异性蛋白磷酸酶16/活化的丝裂原蛋白激酶磷酸酶-7(DUSP16/MKP-7)的乙酰化抑制自噬。Shin DM等指出结核分枝杆菌Eis通过JNK依赖的抑制活性氧(ROS)的产生来负调节自噬、炎症应答、细胞死亡以对抗宿主的免疫防御。eis基因去除导致细胞死亡及对自噬敏感和细胞因子的产生[11]。Eis还通过乙酰化氨基糖苷类的大量胺类而促成抗药性[10]。Ganaie AA[12]指出，Eis氨基葡糖苷乙酰基转移酶在执行其对抗宿主防御的一个重要特性是耐热、对热稳定。结核分枝杆菌还会通过上调IL-6的产生，降低Atg12-Atg5复合物因此抑制自噬体的生成，同时也影响IFN-γ介导的mTOR，p-38和JNK 通路的刺激[13]。

2 抗氧化应激以维持结核分枝杆菌生存的蛋白

氧化应激(Oxidative Stress，OS)被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。结核分枝杆菌侵入巨噬细胞，巨噬细胞产生对结核分枝杆菌有害的活性氧中间物(ROI)或活性氮介质(RNI)，是杀灭结核分枝杆菌的机制之一[14]。结核分枝杆菌之所以在宿主体内可长期潜伏，除了它能抑制巨噬细胞的自噬作用，再就是它本身含有过氧化氢/过氧化物酶等成分，会减少无机或/和有机的过氧化氢/过氧化物[15-17]，如渗透性诱导细菌蛋白C(OsmC)、过氧化氢/过氧化物酶KatG、Cpn60.1、Wag31、小分子硫醇MshD等。OsmC蛋白促进了分枝杆菌总的过氧化氢还原酶，减少无机和有机的过氧化氢[14]。实验证明，表达这些蛋白的基因缺失后结核分枝杆菌在氧化应激作用下的存活率与结核分枝杆菌标准株比较大都会降低。与标准株比较，MshD缺失后对氧化应激抵抗能力减弱，体外培养6 h后，存活率分别为58%和13%[16]。

一些蛋白的相互作用可使在氧化压力下的细胞分裂更顺利的进行，如GTP结合蛋白FtsZ和与其相互作用蛋白A (FipA蛋白)的相互作用，属于DivIVA 家族的Wag31与青霉素结合蛋白(PBP3)相互作用。Sureka K[15]指出结核分枝杆菌在巨噬细胞内生长期延长与FipA蛋白有关。FipA蛋白分布在分枝杆菌的膜上，在氧化压力下，FipA与FtsZ的相互作用在细胞分裂中对FtsZ在隔膜上的定位是必须的。也就是说，分枝杆菌在氧化压力下的繁殖依赖于FipA与FtsZ的相互作用，FipA敲除导致在巨噬细胞内的结核分枝杆菌生长期延长及生长数量的减少。而FipA与FtsZ的相互作用还依赖于另一个蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶(PknA)的磷酸化作用。S.Saikolappan指出PBP3水解对抵抗压力有害，Wag31与PBP3相互作用保护PBP3免受蛋白水解，从而维持结核分枝杆菌在氧化应激下的细胞形态、细胞分裂并抵抗应激[17]。

对于以上这些对维持细菌生长繁殖有利的成分，如果作为药物靶点使之失活或破坏能否杀灭结核分枝杆菌或降低其活力，对此也有研究。Buchmeier NA指出抗氧化应激的小分子硫醇MshD可能是一个抵御胞内结核分枝杆菌的有希望的药物靶点[16]。烷基氢过氧化物还原酶AhpC能提高M. smegmatis标准株对异烟肼(INH)的抵抗力即耐药性，而与AhpC有相似功能的同源蛋白结核分枝杆菌OsmC对异烟肼相关的过氧化物代谢影响不大[14]。另外，也有些蛋白被破坏后反而不利于药物发挥杀菌作用。基因变异或缺失会导致结核分枝杆菌的耐药。研究发现，异烟肼实际上是一个药物前体，发挥抗结核作用需过氧化氢/过氧化物酶KatG蛋白的活化。石君帆[18]通过将质粒KatG基因转移到INH耐药菌株胞内，可使其对INH重新恢复敏感性，而对结核分枝杆菌的临床耐INH菌株进行KatG基因分析发现该基因的缺失或突变是引起耐药的主要原因。

3 抑制细胞凋亡保证结核分枝杆菌繁衍有关蛋白

被结核分枝杆菌感染后的细胞有3种结果：坏死，凋亡或两者共同存活。在感染初期，凋亡是巨噬细胞对抗结核分枝杆菌的一个非常重要的先天性防御机制[19]，凋亡后细胞提呈抗原给树突状细胞，提高获得性免疫。细菌感染后会引起宿主一系列反应，如刺激凋亡信号调节激酶、ROS聚集、一氧化氮的产生、胞内Ca2+浓度上升等，从而诱导感染细胞凋亡的发生。内质网压力应激的应答，肿瘤坏死因子TNF-α及Fas/Fasl的上调，caspase-8的激活可能是诱导细胞凋亡的免疫应答标记；凋亡性死亡会控制细菌的繁殖，降低其在细胞内的生存能力。细菌感染后还可以抑制膜的修复诱导感染的细胞坏死，从而使细菌释放并扩散到新的细胞使其繁殖。但研究显示，毒力的结核分枝杆菌是通过抑制凋亡而不是促进坏死来保证它的繁殖。已经证明，结核分枝杆菌分泌的一些蛋白会抑制细胞的凋亡，如SecA2和超氧化物歧化酶SodA、过氧化氢/过氧化物酶KatG、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknE、Ⅰ型NADH脱氢酶NuoG、Rv3654c、Rv3655c等[20-22]。它们通过对NOX2产生过氧化物的解毒作用，改变与TLRS的关系，调节NO、前炎症细胞因子TNF-α的产生等抑制细胞凋亡的发生。与标准株比较，以上编码基因的缺失变异株感染的细胞凋亡率明显上升，在细胞内的存活力下降，毒力也会减弱，因此认为抑制凋亡能力是细菌毒力的一个标志，也是细菌存活能力的标志。

结核分枝杆菌通过以上机制使其能与宿主共存多年，但其体内也有一些蛋白还能诱导细胞凋亡，已经证明有这个功能的蛋白还不是很多，它们有早期分泌蛋白ESAT-6(Rv3875)，19kDa脂蛋白LpqH(Rv3763)，38kDa脂蛋白PstS-1(phoS或phos1，Rv0934)，PE-PGRS33(Rv1818c)等[23-26]。最近，Si Guo等[27]提出设想，结核杆菌的早期分泌蛋白CFP10和ESAT-6在形成1∶1复合物后通过调节TNF-α的产生在细菌感染的不同阶段能起到调节巨噬细胞死亡的功能。肿瘤坏死因子TNF-α可诱导凋亡或坏死，因此在感染的不同阶段通过产量的变化调节细胞死亡。

结核分枝杆菌进入人体后本身可以通过自我调节适应它的生存，感染人体后能长年在其体内与之共存，与它能够调节宿主的免疫机制是分不开的。如何能打破这种“共存”现象，使这种“共存”现象朝向人类有利的一方面发展，还需要很多研究学者继续努力。

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