GGCX（rs6738645）基因多态性与华法林稳定剂量的关系＊

刘寅强，杨百晖，夏健明，张学玉，张桂敏

（昆明医科大学第一附属医院心血管外科，云南昆明 650032）

GGCX（rs6738645）基因多态性与华法林稳定剂量的关系＊

刘寅强，杨百晖，夏健明，张学玉，张桂敏

（昆明医科大学第一附属医院心血管外科，云南昆明 650032）

目的探讨γ谷氨酰羧化酶（GGCX）（rs6738645）基因型在中国汉族人群中的分布情况，以及其基因多态性与瓣膜置换术后华法林稳定剂量的相关性。方法采用Snapshot技术检测228例研究对象GGCX（rs6738645）位点基因型，研究其基因型及等位基因频率；比较其中176例瓣膜置换术患者基因多态性与华法林稳定剂量的相关性。结果228例研究对象中，GGCX（rs6738645）位点基因型 TT、GT、GG 分别为84例（36.84%）、122例（53.51%）、22例（9.65%），T和 G等位基因的频率分别为63.60%和36.40%；176例瓣膜置换术后患者服用华法林达稳定状态，华法林日维持剂量GG组低于TT、GT组，组间比较差异有统计学意义（P＜0.01）；基因型3组间国际标准化比值（INR）、凝血酶原时间（PT）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论中国汉族人群GGCX（rs6738645）基因多态性可能是瓣膜置换术后华法林个体剂量差异的影响因素。

γ谷氨酰羧化酶；基因多态性；华法林；心脏瓣膜假体植入

华法林是目前使用最广泛的口服抗凝药，也是惟一被美国食品药物管理总局（food and drug administration，FDA）批准的瓣膜置换术后口服抗凝药物［1］。在临床应用中，华法林治疗适应证较窄，个体用药差异较大，近年的研究认为，基因多态性是决定药效的个体差异的主要原因［2－4］。国内外研究表明，γ谷氨酰羧化酶（gamma-glutamyl carboxylation，GGCX）基因多态性与华法林剂量个体差异密切相关［5－6］，目前中国汉族人群的相关研究较少，为了解GGCX（rs6738645）基因型及等位基因在中国汉族人群中的分布情况及其基因多态性对华法林抗凝的影响。本研究应用Snapshot技术对中国汉族人群的GGCX（rs6738645）基因多态性情况进行分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究选取228例中国汉族人群作为研究对象，在取得知情同意书后抽血提取DNA，Snapshot法检测基因多态性。其中52例为健康体检者；176例为瓣膜置换术患者，为2010年1月至2012年3月在昆明医科大学第一附属医院心血管外科行瓣膜置换术后服用华法林抗凝治疗患者，其中男82例，女94例，年龄（44.44±12.33）岁，体质量（59.19±11.03）kg，身高（1.64±0.71）cm。抗凝强度预设国际标准化比值（international normalized ratio，INR）为1.5～2.5，随访3～24个月；瓣膜置换术患者术后均服用华法林抗凝超过2个月，两次复查凝血检查INR达到抗凝预设标准，无需调整剂量，视为达到抗凝稳定状态。记录华法林日维持剂量，凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、INR等指标，入选患者肝、肾功能指标无异常，且未服用影响华法林疗效指标药物。

1.2 方法

1.2.1 样本采集与DNA提取 每例患者在华法林达到稳定剂量时采集静脉血5mL，置于枸橼酸钠抗凝管中作9∶1抗凝（标本1.80mL，抗凝剂0.20mL），2mL用于测定PT、INR，剩余全血3 000r／min离心10min，弃上层血浆，分装，沉淀细胞使用基因组试剂盒快速提取基因组DNA，－20℃保存。

1.2.2 基因分型 设计引物扩增包含 GGCX（rs6738645）位点片段，引物由上海捷瑞公司合成。Taq酶、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）为Fermentas公司产品，PCR仪型号为东胜龙（EDC-810）。多重PCR反应体系含1.00μL模板 DNA，1.50μL 10×buffer缓冲液，1.50 μL MgCL2（25mmol），0.30μL dNTP，0.15μL 引物混合（20P），0.30μL Taq聚合酶，补水至15.00μL。扩增条件：95℃预变性3min；94℃变性15s，60℃退火15s，－0.5℃（每循环降温0.5℃）11个循环；72℃延伸30s，94℃变性15s，54℃退火15s，72℃延伸30s，72℃加长延伸3min，共24个循环，扩增后取3μL PCR产物用于ExoⅠ和Sap纯化，主要是去除反应产物中的引物及dNTP。37℃保持45min，80℃保持15min，纯化好后进行延伸反应，预先混好延伸引物。延伸反应体系：PCR产物2.00μL，Snapshot Mix试剂1.00μL，延伸引物混合2.00μL，补水至6.00μL，96℃预变性1min，96℃变性10s，52℃退火5s30个循环。取1.00μL延伸产物，加8.00μL上样缓冲液，95℃变性3min，立即冰水浴。测序仪型号为ABI 3730XL，研究随机抽取10%样本进行重复检验。

图1 GGCX（rs6738645）基因型的Snapshot峰型序列分析

1.3 统计学处理 用SPSS13.0统计软件进行数据处理，用χ2检验判断等位基因频率和基因型频率分布是否符合Hardy－Weinberg平衡。单因素方差分析基因多态性与稳定状态时华法林抗凝指标相关性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 样本基因型的判定 样本的基因型通过Snapshot技术测序，各基因型的峰型测序结果，见图1。

2.2 GGCX（rs6738645）等位基因和基因型分布频率 228例研究对象中GGCX（rs6738645）位点基因型TT、GT、GG分别为84例（36.84%）、122例（53.51%）、22例（9.65%），T 和 G等位基因的频率分别为63.60%和36.40%；预期基因型TT、GT和 GG 分 别 有92例（40.35%）、106例（46.49%）、30例（13.16%），经χ2检验分析，所选随机人群 GGCX（rs6738645）等位基因频率和基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡（χ2＝0.592，P＝0.501）。

表1 基因多态性与稳定状态华法林抗凝的相关性（±s，n＝176）

表1 基因多态性与稳定状态华法林抗凝的相关性（±s，n＝176）

基因型 n INR PT 华法林（mg／d）TT 62 1.85±0.27 21.26±2.16 3.13±0.87 GT 96 1.88±0.20 21.65±1.70 3.20±0.95 GG 18 1.93±0.27 21.97±2.30 1.85±0.73 F 0.420 0.611 8.805 P 0.658 0.545 0.000

2.3 GGCX（rs6738645）基因多态性对华法林抗凝的影响176瓣膜置换术患者，基因型TT、GT、GG分别为62例，96例，18例，当达到稳定抗凝状态时，GGCX（rs6738645）基因型3组INR、PT比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；华法林日维持剂量GG型低于TT、GT型，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

3 讨 论

人工机械瓣膜置换术后患者需要终身服用华法林抗凝治疗，但华法林治疗适应证较窄，个体用药差异大，容易导致出血、栓塞等严重并发症。近年来，国内外研究表明，基因多态性与华法林剂量有重要相关性［7－10］。GGCX是维生素K循环中的关键酶，其作用是将无活性的维生素K依赖性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的前体羧化后成为有活性的凝血因子，近年的研究表明，GGCX是影响抗凝药华法林剂量个体差异的遗传因素之一［11－12］，其中研究较多的是 G3261A（rs12714145）位点多态性与华法林剂量个体差异的相关性，但对于GGCX（rs6738645）位点多态性的研究，国内少有相关报道。

本研究中，采用了Snapshot技术，对中国汉族人群GGCX（rs6738645）基因多态性进行分析。研究结果显示，228例中国汉族人群GGCX（rs6738645）位点的基因型TT、GT、GG分别为84例（36.84%）、122例（53.51%）、22例（9.65%），T 和 G等位基因的频率分别为63.60%和36.40%；预期基因型TT、GT和 GG 分别为92例 （40.35%）、106例 （46.49%）、30 例（13.16%），经χ2检验分析，所选人群 GGCX（rs6738645）等位基因频率和基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡（χ2＝0.592，P＝0.501）。其中少数等位基因 G的频率为36.40%。台湾人群研究显示，少数等位基因频率为39.25%［13］；Wadelius等［14］对欧洲人群研究显示，少数等位基因频率为30%，与本研究结果基本一致。本研究对176例瓣膜置换术后华法林抗凝治疗的患者进行基因多态性测序，176瓣膜置换术患者，基因型TT、GT、GG分别为62例，96例，18例，当达到稳定抗凝状态时，GGCX（rs6738645）基因型3组INR、PT比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；华法林日维持剂量比较，GG型低于TT、GT型，差异有统计学意义（P＜0.01）。台湾人群研究显示，华法林日维持剂量与基因多态性无显著相关性（P＝0.914）［13］；对欧洲人群研究显示，华法林日维持剂量与 GGCX（rs6738645）基因多态性具有显著相关性（P＜0.05）［6.14－16］，研究结果在不同人群间存在差异，可能与不同人种间基因多态性差异相关。

综上所述，本文初步得出中国汉族人群GGCX（rs6738645）基因型及等位基因分布频率，并且证实其基因多态性与华法林剂量有显著相关性，其基因多态性可能是华法林剂量个体性差异的影响因素，但本研究样本例数较少，需要进一步明确GGCX（rs6738645）基因多态性与华法林抗凝的相关情况，尚需今后扩大样本量进行深入研究。

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Research on correlation between GGCX（rs6738645）polymorphism and warfarin stable dose＊

LiuYinqiang，YangBaihui，XiaJianming，ZhangXueyu，ZhangGuimin
（DepartmentofCardiovascularSurgery，FirstAffiliatedHospital，KunmingMedicalUniversity，Kunming，Yunnan650032，China）

ObjectiveTo investigate the gamma glutamine carboxylase（GGCX，rs6738645）genotype distribution in Chinese Han population and the correlation between GGCX（rs6738645）polymorphism and the warfarin stable dose in the patient after valve replacement.MethodsThe genotypes of 228cases were detected by the Snapshot technology in order to explore the genotype and allele frequencies.The correlation between the gene polymorphism in 176cases after valve replacement and the stable dose of warfarin was compared.ResultsIn total of 228research subjects，the number of TT，GT and GG genotype were 84（36.84%），122（53.51%）and 22（9.65%）.The frequencies of T and G allele were 63.60%and 36.40%respectively；in 176patients after the valve replacement，the maintenance stable dose of warfarin was lower in GG group than in the TT and GT groups，the differences between the groups showed statistical significance（P＜0.01）.The PT value and INR value had no statistical difference among 3 genotype groups（P＞0.05）.ConclusionThe GGCX（rs6738645）polymorphism in Chinese Han population may be the influencing factor of warfarin individual dose difference in the patients after valve replacement.

gamma-glutamyl carboxylation；gene polymorphism；warfarin；heart valve prosthesis implantation

10.3969／j.issn.1671-8348.2014.10.010

A

1671-8348（2014）10-1184-03

云南省创新团队计划资助项目（2011CI137）。

刘寅强（1980－），主治医师，在读博士研究生，主要从事心血管外科疾病分子生物学研究。

2013-09-20

2013-12-24）

论著·临床研究