去泛素化酶BRCC36功能的研究进展

李如君， 龚开政， 张振刚

去泛素化酶是自然界中广泛存在于真核细胞内的一种生物活性酶，它与泛素化酶的作用相反，可将泛素或泛素链从底物上去除。BRCC36(BRCA1-BRCA2-containing complex subunit 36)是2003年发现的去泛素化酶家族新成员，属于 JAMM(Jab1/MPN/Mov34 metalloenzyme)/MPN+(Mpr1/Pad1 N-terminal)亚类，参于DNA损伤修复、细胞信号转导及细胞周期控制等多种细胞活动，在肿瘤发生、血管生成、抗心肌损伤过程中均发挥重要作用。不同于泛素化酶的种类繁多、可作用于某一特定环节，人体内的去泛素化酶仅发现不到80种，提示其具有多种生物学功能。目前关于去泛素化酶BRCC36的研究还存在争议，因此研究去泛素化酶的结构、作用形式、生理学功能可望给疾病新型治疗靶点的探索提供必要的信息，具有较大的临床意义。

1 BRCC36的结构和归属

BRCC36是由BRCC3基因编码，含316个氨基酸，分子量为36 kD的多肽［1］。最初发现 BRCC36是BRCA1-BRCA2-containing complex(BRCC)中的一个亚基，其基因位于人类X染色体长臂28区，该蛋白又被称为C6.1A、CXorf53或 RP11-143H17.2。不同于泛素化酶可以催化底物蛋白进行泛素化修饰，该蛋白是一种相反的可以特异性从底物蛋白上移除聚泛素链的酶，即去泛素化酶(deubiqui-tinating enzymes，DUBs)。到目前为止人类已发现了600余种泛素化酶，但去泛素化酶仅有不到80种，这也意味着去泛素化酶功能的调控可能与其相连接的蛋白质有关。根据同源性，去泛素化酶目前可分成5大类，即泛素羧基末端水解酶家族(ubiquitin C-terminal hydrolases，UCHs)、泛素特异性蛋白酶家族(ubiquitin-specific proteases，USPs)、卵巢肿瘤结构域蛋白酶(ovarian tumor domain proteases，OTUs)、Josephin 和JAMM/MPN+蛋白酶家族［2］。除了 JAMM/MPN+蛋白酶家族是金属肽酶外，其余4类去泛素化酶均属于半胱氨酸蛋白酶。BRCC36是JAMM/MPN+蛋白酶家族成员之一，目前该家族中被报告的其它成员有26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基14［26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 14;一种人类PAD1(proteasome alpha subunit 1)的类似物，在酵母细胞中的同源物被称为 Rpn11］［3］、CSN5(COP9 信号体亚基)［4］、与胞内分选复合物运输相关(ESCRT machinery-associated)的去泛素化酶AMSH(associat-ed molecule with the SH3 domain of STAM1)和AMSHLP(AMSH-like protease)［5］。该家族 DUBs的特点是含有JAMM/MPN+结构域，其中包含2个组氨酸残基和1个天冬氨酸残基，可与二价锌离子稳定结合形成催化中心，发挥去泛素化作用［6］。BRCC36可特异性识别泛素间通过第63位赖氨酸残基(K)连接形成的泛素链，并对其进行水解从而减弱靶物的泛素化修饰程度，其余成员均具有特异性水解K63位聚泛素链的功能［7］。研究已证实，通过K63位点连接的聚泛素链所介导的泛素化修饰在DNA损伤修复［8］、NF-κB 信号转导［9］、细胞周期和核糖体功能控制［10］、蛋白质靶向运输［11］中发挥重要作用。

2 BRCC36参与形成的复合物

在细胞内，BRCC36主要通过参与 BRCC和BRISC(BRCC36-containing isopeptidase complex)这2种复合物的形成来发挥作用。免疫染色显示BRCC复合物定位于细胞核，由 BRCC36、BRCA1、BRCA2、Merit40/NBA1、 BARD1、 RAD51、 BRCC45/BRE、RAP80和Abraxas/CCDC98等亚基组成;BRISC复合物则定位于细胞质，由 BRCC36、BRCC45/BRE、Merit40/NBA1和Abro1/KIAA0157亚基组成，2种复合物中的 Abraxas(即 CCDC98)和 Abro1(即KIAA0157)分别分布在胞核和胞质，其动态平衡可共同调节 BRCC36的活性及细胞内定位［8］。Feng等［2］研究显示，敲除内源性 Abraxas可导致胞核内BRCC36水平显著下降;而消减Abro1则使胞质中BRCC36含量显著减少，但胞核内无明显变化。他们认为一方面与二者参与形成的复合物减少有关，另一方面与其可调节BRCC36同复合物中其它亚基的亲和力有关。此外，机体还可通过调节2种复合物之间的比例来应对不同细胞事件对DUB活性的需要。例如通过下调Abro1导致胞质中BRISC复合物的减少、胞核中BRCC复合物相应增多，从而应对DNA损伤修复时对BRCC复合物的大量需求。Hu等［12］还发现，2种 BRCC36复合物共有组成亚基Merit40(即NBA1)和BRCC45(即BRE)的相互作用对维持复合物的完整性发挥关键作用。在细胞内消减这2种亚基的任意一个都会引发复合物中其余亚基表达减少，且复合物的稳定性降低，易被蛋白酶体降解。这是由于Merit40羧基端保守序列PXXR可通过与BRCC45羧基端第2个UEV(ubiquitin-conjugating enzyme variant)域相作用，共同维持BRCC36复合物的完整性;并且Merit40可促使BRCA1聚集在DNA损伤部位，参与BRCC复合物介导的DNA损伤修复。这表明，BRCC36通过与复合物中其余亚基的交互来发挥作用。研究发现［8］，在BRISC复合物中，Abro1是BRCC36发挥作用的必需亚基;而缺乏BRCC45则无法探测出BRCC复合物具有DUB活性。研究者观察到BRCC45的2个UEV域变异后并不影响其与其余亚基的相互作用，提示其通过其它途径影响DUB活性，但具体机制尚待进一步研究。

3 BRCC36已知细胞生物学功能

由于目前仅发现不到80种去泛素化酶，提示去泛素化酶可参与多种代谢活动。其中BRCC36参与的K63位点去泛素化修饰调控，已被证实具有多种生物学功能。

3.1 参与DNA损伤修复 多种内外源性理化、生物因素均会导致基因组发生损伤，人类每天会发生至少10 000处DNA损伤，尤其是DNA双链断裂(DNA double-strand breaks，DSBs)可导致基因突变、甚至细胞死亡。而细胞主要通过同源重组(homologous recombination，HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)来进行 DSBs修复工作［13］，研究表明 BRCC36均参与了上述过程。Block-Schmidt等［14］发 现，植 物 阿 拉 伯 芥 存 在BRCC36同源基因AtBRCC36A和AtBRCC36B。前者的突变会导致染色体之间及自身内部出现严重的同源重组修复异常，而后者的突变则基本无影响，是否作为细胞内BRCC36的冗余尚需进一步研究;但缺失任意一种BRCC36基因均会使得细胞对DNA交联剂的敏感性下降，提示两者在DNA交叉连接修复(DNA crosslink repair)中均起作用。此外还发现BRCC36发挥去泛素化作用要先于BRCA1的磷酸化，此点可作为研究BRCC复合物依赖的HR修复具体过程的依据。Coleman等［15］发现，细胞内缺失BRCC36会引起DSBs时核酸酶对DNA 5′端过度切除，并相应地引起依靠3′端突出段为模板的同源重组修复增强，这种过度的同源重组修复会损害基因组的完整性。

3.2 参与细胞周期调控 细胞在进行增殖时，通常会经历一个G2/M期关卡，用于检测DNA是否存在缺陷。当关卡检测到严重的缺陷及损伤时，细胞会暂时停止增殖，并启动相应修复机制。若修复成功则继续增殖，若修复失败则启动相应细胞死亡程序。BRCC36可降低关卡对DNA损伤的容忍度。Dong等［1］发现，消减细胞内BRCC36和BRCC45的表达，会导致G2/M期关卡的作用消失。尤其是消减BRCC36至原先水平33%以下时，细胞将绕过自检程序进入有丝分裂，导致DNA存在的缺陷遗传给下一代细胞，使得子代抗损伤能力下降，生存能力明显减弱。研究还发现散发性乳房肿瘤患者的肿瘤细胞中BRCC36异常高表达，表现为肿瘤细胞对放射治疗不敏感;而消减BRCC36却使得细胞对电离辐射的敏感性增强［16］。这与 BRCC36增强了关卡对DNA损伤的检查并启动相应DNA修复有关。对于该点的深入研究，可成为提高癌症患者放疗疗效的新靶点，BRCC36也有望成为检测放疗敏感性的新指标。

3.3 参与细胞内信号转导 经典的转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)信号通路已被证实在细胞分化、增殖、迁移、免疫应答，炎症反应中发挥重要作用［17-18］，由其是在慢性压力负荷等致心肌肥厚因素刺激下，心肌内TGF-β1表达显著增加。而我们新近的研究显示［19］，在肺动脉平滑肌细胞中，环磷酸鸟苷(cGMP)可使胞浆内的β2-微管蛋白扣押转化生长因子β1通路胞内主要效应蛋白Smad3，从而抑制该通路，并发现扣押时与Smad3，结合的BRCC36明显增加，提示BRCC36可能通过调节Smad3的泛素化修饰来参与TGF-β1信号通路的调节。但目前国内外尚无报道，我们现正对这一课题进行研究。此外，核因子κB(NF-κB)信号通路的研究证实［9］，对肿瘤坏死因子受体相关因子(TNF receptor-associated factor)2、6的K63位点泛素化修饰的移除，可负向调节该通路，提示BRCC36可通过对NF-κB通路关键转换因子的去泛素化修饰来发挥调节作用。

3.4 参与泛素化修饰调节 BRCC36可特异性移除靶物K63位点的泛素，是其生物学功能的基础。众所周知，DNA损伤后可诱导 ATM/ATR使组蛋白H2AX的S139上发生磷酸化来招募MDC1因子，随后MDC1磷酸化来促使泛素连接酶RNF8/UBC13和RNF168/UBC13在受损染色质部位连接上K63位点聚泛素链，为BRCC复合物创造出一个停泊位点，并促使 BRCA1向此部位聚集［12］。BRCC复合物中Rap80的串联泛素作用域(ubiquitin interaction motif，UIM)可特异性识别K63位点聚泛素链修饰的染色质，介导修复因子的定位［20］。而修复完成后泛素化信号的及时解除至关重要。研究指出［21］，Rap80通过介导复合物中BRCC36在DNA受损部位定位，通过BRCC36特异性水解K63位点聚泛素链来提供损伤修复后的终止信号，从而解除G2/M期关卡对细胞周期的阻滞，使细胞恢复增殖能力。在胞质中，虽然BRCC36参与了BRISC复合物的组成，但该复合物对连接在K48、63位点的聚泛素链亲和力相同。之所以BRISC复合物仅水解K63位点聚泛素链，并非由于其特异性识别该聚泛素链，而是由于底物与酶催化部位连接的特殊构象。因为K63位点上形成的聚泛素链其内部的异肽链构象有利于BRCC36发挥水解作用［22］。但有研究也发现，BRCC36还可增强特定泛素连接酶的活性，从而上调泛素化水平。例如BRCC36可能通过抑制BRCA1的底物或泛素交联酶(E2)结合位点发生泛素化修饰，从而增强BRCA1复合物泛素连接酶(E3)活性达20倍［23］。因此，BRCC36的多功能形态值得进一步深入研究。

4 BRCC36与疾病的关系

越来越多的证据显示BRCC36参与了多种疾病的发生过程。Chen等［16］研究发现，BRCC36在绝大多数的乳房肿瘤中异常高表达。消减肿瘤细胞内BRCC36水平并不会影响细胞的正常生长，但给予一定剂量的电离辐射后，细胞凋亡明显增加。这与缺乏BRCC36导致的BRCA1无法正常磷酸化及其无法在受损DNA部位形成修复核灶有关。Cilenti等［24］研究发现，Abro1参与的 BRCC36调控可能是一种新型的心脏保护机制。他们在心肌梗死患者的病变心肌区域发现Abro1水平显著增高。通过对心肌缺血再灌注损伤模型的研究显示，增加Abro1会引起具有K63位点泛素化修饰的蛋白靶物显著减少，可明显减少氧化应激诱导的细胞凋亡;而降低Abro1的水平则相反，会加重由于缺血及再灌注所导致的心肌细胞损伤及凋亡。但作者并未指出K63泛素化修饰水平的下降与BRCC36有直接关系，需要进一步探索。此外，Singh通过对敲除了BRCC复合物中关键成份BRCA2的转基因小鼠研究发现［25］，当给予具有心脏毒性的抗肿瘤药物多柔比星后，转基因小鼠比野生对照鼠出现了更为显著的心脏毒害反应，包括更为严重的心功能不全、全组死亡率提高及更为广泛的DSBs和修复核灶形成明显不足，左心室病理切片也反映出更多的心肌细胞凋亡。这与消减BRCC36引起的BRCC复合物减少导致的DNA损伤修复能力减弱一致。相关的研究还涉及了BRCA1在心力衰竭、缺血再灌注损伤中所起的作用，都表明减弱DNA的修复会导致更为严重的心脏病变。Miskinyte等［26］对综合性烟雾病的研究发现，BRCC3基因的缺失，是导致该病发生的重要原因。通过基因敲除技术暂时去除斑马鱼的BRCC3基因也出现了血管形成障碍，而通过补充BRCC36则可逆转这一现象，提示BRCC36在血管形成中发挥重要作用。

5 展望

综上所述，BRCC36作为生物体内为数不多的特异性K63位点去泛素化酶，参与多种细胞活动，在DNA修复、信号转导、细胞周期控制、血管形成等调控中发挥重要作用;其调控主要通过与BRCC36复合物中其它亚基的相互作用而实现;与乳房肿瘤、心脏缺血缺氧损伤、烟雾综合征等疾病的发生联系密切。对其深入研究，可成为提高肿瘤放疗效果的靶点［16］和预测心脏疾病发生风险的敏感指标［27］，具有较强的临床价值。

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