Hedgehog信号通路与肝损伤：可能的药物作用靶点

连娜琦，吴夏飞，陆春风，张 峰，陆 茵，2，郑仕中，2

肝损伤是肝纤维化发生的第一步，当肝脏受到病毒、药物、酒精等致病因素的损伤后，引发多种肝细胞参与的肝损伤修复反应，其理想状态是受损的肝脏上皮细胞被新生健康的上皮细胞替代以完成肝组织再生，肝脏祖细胞在这一过程中发挥了重要作用［1］。然而，肝脏含有大量的上皮细胞和间质细胞，而间质细胞的参与往往引发肝脏炎症反应、血管重构和肝脏形态异常及功能障碍，并最终导致肝纤维和肝硬化的发生［2］。Hh信号通路［3－5］是一条具有调节细胞的增殖、凋亡、迁徙和分化功能的信号通路，随着研究的深入发现它能在各种急性及慢性肝损伤所致的肝脏疾病中被激活，并参与肝损伤修复反应的多方面过程，包括肝祖细胞的增殖，肌成纤维细胞的转化与生成，肝脏多种细胞的凋亡，肝损伤引起的炎症反应以及血管重塑过程等。本文就近年来Hh信号通路参与肝损伤修复反应的机制研究作一综述，并对其可能的药物作用靶点进行展望。

1 Hh信号通路

Hh信号通路［6］由Hh蛋白、靶细胞膜上两种蛋白受体（Patched，Ptc）和（Smoothened，Smo）及 3种锌指转录因子（Gli1，Gli2，Gli3）组成。哺乳动物中存在3种Hh的同源基因（Sonic Hedgehog，SHH）、（Indian Hedgehog，IHH）和（Desert Hedgehog，DHH），它们分别编码 Shh、Ihh和 Dhh蛋白。Hh蛋白家族成员均由两个结构域组成：氨基端结构域（Hh-N）及羧基端结构域（Hh-C），其中Hh-N有Hh蛋白的信号活性，而Hh-C则具有自身蛋白水解酶活性及胆固醇转移酶功能。Hh信号转导受靶细胞膜上两种跨膜蛋白控制。正常情况下［7］，驱动蛋白样分子（Costal2，Cos2）、丝／苏氨酸激酶（Fused，Fus）、丝／苏氨酸激酶抑制因子（Sufu）及 Gli，然后以Gli为主形成了一个大的Cos2复合物锚定于微管上。定位于细胞内小泡的Smo，可通过Hh－C端直接与Cos2蛋白复合物作用，Ptc与Smo结合，Smo活性被抑制，此时下游的Hh信号的终端传递者Gli蛋白在蛋白酶体内被截断，并以羧基端被截断的形式进入细胞核内，抑制下游靶基因的转录。经典的Hh活化机制是［7］，Hh配体先合成前肽，经过自动的催化裂解产生一个N-末端片段，再经胆固醇和异戊烯基脂质修饰后转移至质膜并释放到胞外。Ptc与Hh结合解除Ptc对Smo的抑制作用，促使Gli蛋白、蛋白激酶A、激活的Smo、Cos2、Fus、Sufu形成复合物并从微管上解离出来，全长Gli蛋白进入核内激活下游靶基因转录。下游靶基因包括纤维生长因子、胰岛素样生长因子2、细胞周期蛋白D1、Hh相互作用蛋白（hedgehog-interaction protein，Hhip）等［8］。Hhip作为抑制因子能够与Ptc竞争性结合Hh配体，降低Hh配体激活Hh信号通路的能力［9］。

经典的Hh信号通路活化依赖于Hh配体解除Ptc对Smo的抑制作用从而活化信号通路，然而，还存在另一种活化机制［10］，如转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）在没有活化Smo的前提下直接使Gli转录从而调节下游靶基因的表达，同时Hh转录因子也可影响TGF-β靶基因以及Wnt信号通路相关因子的表达［11］。另外，有研究［12］称胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）有抑制GLI磷酸化降解的作用，而表皮生长因子［13］（epidermal growth factor，EGF）能促进胰腺癌细胞表达 Shh。IGF、EGF、TGF-β均是目前已知的与肝脏再生相关的因子［14］。综上所述，Hh信号通路是一个复杂信号网络中的一部分，它与TGF-β和Wnt等信号通路共同参与调节肝脏损伤修复过程。

2 Hh信号通路在肝损伤中的作用

临床上常见的慢性持续性的肝脏损伤，肝功能损害表现明显，肝细胞损伤范围广、数量多、无法仅仅依靠肝细胞再生完成修复，往往需要在非实质性的细胞协助下进行结缔组织的瘢痕修复。而反复持续的慢性肝损伤，导致肝细胞坏死增多、肌成纤维细胞活化增殖及大量的胶原纤维沉积，最终导致肝脏广泛的纤维化，甚至肝硬化［15］。Wynn等［16］近期针对成人或是动物肝硬化的大量研究，已证明肝硬化的肝脏中Hh信号通路处于激活状态，同时Hh信号通路也参与调节了肝脏损伤修复的多个方面。

2.1 Hh信号通路促进肝祖细胞生成

普遍认为，包括卵圆细胞和未成熟的胆管细胞在内的肝祖细胞群对慢性肝损伤肝脏再生具有重要意义［17］。然而到目前为止，对受损肝脏如何动员此类细胞的机制却所知甚少。健康成年人的肝脏中含有少量的肝祖细胞群，它们集中在Hering管中。免疫组化分析结果显示Hh配体、Hh调节的转录因子和 Hh靶基因在 Hering管中表达［18］。相关研究［1］证实了肝祖细胞是Hh配体的受体细胞，它们依赖Hh信号通路维持活性，Hh配体可抑制这些细胞凋亡，促进其增殖。Ochoa等［19］通过实验发现Hh信号通路抑制剂环杷明使肝脏部分切除（partial hepatectomy，PH）处理过的小鼠体内肝祖细胞标志物甲胎蛋白、角蛋白的表达减少。除了在急性肝损伤模型中发现Hh对肝祖细胞的影响外，Fleig等［18］通过慢性动物肝损伤模型也得出Hh配体促进肝祖细胞生成的结论。有报道［20］称丧失使Hh信号通路恢复安静能力的肝损伤转基因小鼠体内肝祖细胞大量增殖。另外，大量的研究［21－25］显示各种慢性肝损伤疾病如原发性胆汁性肝硬化、酒精性脂肪性肝硬化、非酒精性脂肪肝以及慢性乙肝病毒性肝炎和丙肝病毒性肝炎中也存在Hh信号通路激活和肝祖细胞生成的这种关系，即Hh信号通路可通过促进肝祖细胞增殖发挥使受损肝细胞被新生健康肝细胞替换的作用。由于Hh信号通路在各种急、慢性肝损伤动物模型及慢性肝损伤疾病中均显示了对肝祖细胞的重要作用，而肝祖细胞被认为是新生肝实质细胞再生的主要来源。因此我们推测Hh信号通路可作为抑制不利于急慢性肝损伤疾病恢复的肝脏再生性修复反应的理想药物作用靶标。

2.2 Hh信号通路的激活是上皮－间质转化（EMT）的重要调节机制 肌成纤维细胞在肝脏损伤修复过程中发挥了重要作用。曾经我们认为只有静止的肝星状细胞（quiescent hepatic stellate cell，Q-HSC）才能活化成为肌成纤维样肝星状细胞（myofibroblast-hepatic stellate cell，MF-HSC）。进一步研究［26］发现肌成纤维细胞的来源还包括肝祖细胞、胆管上皮细胞以及窦状内皮细胞等。它们通过一个共同的机制即上皮－间质细胞表型转换过程（epithelial-mesenchymal transition，EMT），由具有上皮表型的 Q-HSC、肝祖细胞、胆管上皮细胞以及窦状内皮细胞转换成为具有间质细胞表型的成熟肌成纤维细胞［27］。

MF-HSC是肝脏内主要的肌成纤维细胞。慢性肝脏损伤时，HSC被激活并产生大量胶原基质从而促进肝纤维化的形成。因此，HSC的活化是肝纤维化形成的中心环节。关于Hh信号通路在肝星状细胞中诱导EMT的机制已经有过系统的研究。Q-HSC具有一些间质细胞的特点，它们表达结蛋白和其它一些间质细胞相关的转录因子［26］。然而，Q-HSC却不表达典型的间质细胞标志基因，包括α-SMA和胶原蛋白1A1（collagen 1A1，col1A1），而表达氧化物酶体增生物激活受体、胶质纤维酸性蛋白、E-钙粘蛋白和角蛋白这些上皮型细胞标志物［26］，这说明Q-HSC是上皮型细胞。另有研究证明［28］Q-HSC表达高水平的Hhip，而Hh配体和其他Hh靶基因如Glis的mRNAs几乎检测不到。将Q-HSC细胞在含有血清的基质中培养24 h后，Hhip的表达下降90%，并伴随着Shh的产生和Hh信号通路的激活，当Hh信号通路活化后，负向调节静止／上皮细胞标志物的表达并逐渐上调肌成纤维母细胞相关基因的表达，包括α-SMA、col1A1、波形蛋白和snail（一种能介导 TGF-β诱导EMT的Gli敏感的转录因子）。当Q-HSC转变为肌纤维母细胞后，给予细胞的Hh信号通路特异性抑制剂环杷明，结果是间质表型标志物基因表达降低，上皮表型标志物基因表达恢复，引起MF-HSC迁徙／浸润表型消失，环杷明明显抑制 HSC的活化［28］。除了HSC，Hh信号通路还可促进未成熟的胆管上皮细胞产单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1），这种因子具有募集单核细胞／成纤维细胞的功能［29］。而白介素-13（interleukin-13，IL-13）能够促进单核细胞分化为成纤维细胞，有报道称Hh信号通路正向调节IL-13的表达［30］。Ochoa等［19］利用PH急性肝损伤模型发现Hh激活的同时也伴随着肌成纤维数量增多和细胞外基质的堆积，而这种现象却因环杷明的干预而消失。Philips等［31］给以 Mdr2（－／－）小鼠（Mdr2基因敲除的肝损伤模型小鼠）Hh信号通路的特异性小分子抑制剂GDC-0449能减少肌成纤维细胞的数量。Omenetti等［29］发现在Hh信号通路持续激活的转基因小鼠体内积累了大量的肌成纤维细胞。综上所述，由肝损伤引起Hh信号通路活化是肌成纤维细胞生成的重要因素。

2.3 Hh信号通路与肝脏血管重塑 近年来基础与临床研究均证实，肝纤维化时发生病理性血管生成与肝窦重构，对于肝纤维化的进展及治疗预后有重大影响［32］。调控肝纤维化病理性血管生成极有可能成为防治肝纤维化的全新策略。存在于肝窦内皮细胞周围的受损肝细胞，活化的HSC，肝祖细胞及一些固有淋巴细胞均有产生Hh配体的能力。Vokes等［33］认为在胚胎发育期Hh信号通路就有促进血管发生的作用。能够激活肝脏细胞群中Hh信号通路的血小板衍生因子具有调节肝脏血管构建的作用也得到实验证实［34］。Xie等［3］利用 Hh信号通路激动剂，抑制剂环杷明、5E1、GDC-0449，以及利用腺病毒使Smoloxp／loxp转基因小鼠Smo表达沉默等方法控制肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSEC）中Hh信号通路的活性，探究 Hh信号通路对LSEC血管发生的影响，得到的实验结果是在肝损伤的小鼠模型中，所有使Hh信号通路安静的手段都能抑制LSEC血管生成。近年来有关HSC促进与肝纤维化相关的血管生成说法也引起了关注。有学者发现［35］在胆管结扎所致的肝纤维化大鼠将来源于HSC或未成熟的胆管上皮细胞的含有Hh配体的膜质颗粒释放到血浆和胆汁中。有趣的是［35］，这些膜质颗粒能促进LSEC发生毛细血管化。血管新生在不同损伤因素导致的肝纤维化中普遍存在，其既是慢性肝损伤后组织修复过程中血管重塑的重要表现，也与纤维化发展及并发症密切相关。因此研究Hh信号通路对血管新生在肝纤维化病理过程中的作用将有助于深入揭示肝纤维化的病理机制，为寻找到有效的诊断标志、治疗靶点以及药物干预治疗提供崭新的视角。

2.4 Hh信号通路与肝脏细胞的凋亡 肝损伤过程中，出现大量的肝实质和非实质细胞凋亡现象。有报道称［36－37］Hh信号通路能够抑制多种肝细胞凋亡。其中尤为典型的属胆管细胞。胆管细胞是Hh信号通路的感应细胞。Hh信号通路通过GLI3与死亡受体-4（death receptor-4，DR4）启动子结合抑制DR4的转录，负向调节miR-29b促进抗凋亡因子（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）的表达发挥抗胆管细胞凋亡的作用［38］。除了胆管细胞，Hh信号通路对肝星状细胞凋亡也有抑制作用［17］，然而其机制仍有待进一步探究。研究人员发现［39］给以肝癌细胞Hh配体中和抗体5E1和环杷明后，肝癌细胞发生凋亡。总之，Hh信号通路对各类肝脏细胞存活机制均有调节作用，其中主要是抑制凋亡作用。然而，若活化的肝星状细胞或肝癌细胞的凋亡受到抑制将导致疾病的严重化，因此可通过抑制Hh信号通路的活化治疗肝损伤引起的肝脏疾病。

2.5 Hh信号作为肝损伤的治疗靶点 既然肝损伤时Hh信号通路的过度激活参与其发病过程，调控Hh的活性自然成了肝损伤治疗的一个靶点。鉴于Hh信号通路的激活途径和以上提及的实验研究，目前应用于Hh参与肝损伤修复机制研究的抑制剂主要是5E1、环杷明和GDC-0449这3种。Hh配体的中和抗体5E1阻断了Hh配体与Ptch结合这一过程［3］。环杷明［3］是一种异甾体类生物碱，通过与 Hedgehog信号通路中的Smoothened蛋白结合抑制该蛋白活性发挥阻断Hedgehog信号通路的作用。而GDC-0449［40］作为一种新型及特定合成的小分子抑制剂，作用于Hedgehog信号通路，阻断Hedgehog配位体，即细胞表面受体Ptc及Smo的活性，从而阻断Hedgehog信号通路。

3 总结与展望

综上所述，肝脏的损伤修复反应同机体的其它组织一样是各类细胞协同作用的结果。在肝脏中，这些细胞包括肝祖细胞、胆管细胞、炎症细胞及肌成纤维细胞等。Hh信号通路作用于这些细胞并且参与肝损伤修复过程中的各个方面的说法也得到了大量实验数据的支持。然而，将Hh作为一个肝损伤治疗靶点虽然在实验研究方面取得了较好的效果，但是若想以Hh信号通路为治疗靶点应用于临床治疗肝损伤疾病，仍存在一些亟待解决的问题。首先，从肝脏疾病的治疗角度考虑，Hh信号通路在一定程度上的激活是机体生理需要和防御反应的表现，但过度激活则促进肝损伤的重症化及各种并发症的发生。因此，今后的实际应用和实验研究应针对不同原因的肝损伤疾病探讨其发病过程中Hh活性的变化规律，为Hh靶向治疗中选择病程中恰当的时间点和适量的Hh抑制剂提供参考，从而达到精确调控Hh的活化，使其活性既处于正常的生理或防御功能状态，又不至于介导过度的促纤维化反应的治疗效果。其次，虽然以环杷明，5E1及GDC-0449为代表的Hh信号通路抑制剂在动物和细胞实验中对肝损伤疾病的疗效显著，然而至今鲜有关于它们作为临床用药治疗肝损伤的报道。因此，还需要进一步阐明Hh介导的肝损伤修复机制，使开发以Hh为靶标治疗肝损伤疾病的临床药物成为可能。虽然目前关于Hh信号通路与肝损伤的研究仍处于实验阶段，但仍具有非常广阔的应用前景和治疗价值。

参考文献：

［1］ Coombes J D，Syn W K.Hedgehog-responsive progenitors：predictors of liver outcomes［J］.Hepatol，2012，56（5）：2010－1.

［2］ Matz-Soja M，Hovhannisyan A，Gebhardt R.Hedgehog signalling pathway in adult liver：a major new player in hepatocyte metabolism and zonation［J］.Med Hypotheses，2013，80（5）：589－94.

［3］ Xie G，Choi SS，Syn WK，et al.Hedgehog signalling regulates liver sinusoidal endothelial cell capillarisation［J］.Gut，2013，62（2）：299－309.

［4］ Grzelak CA，Martelotto L G，Sigglekow N D，et al.The intrahepatic signalling Niche of Hedgehog isdefined by primary Cilia positive cells during chronic liver injury［J］.J Hepatol，2014，60（1）：143－51.

［5］ Guy CD，Suzuki A，Zdanowicz M，et al.Hedgehog pathway activation parallels histologic severity of injury and fibrosis in human nonalcoholic fatty liver disease［J］.Hepatology，2012，55（6）：1711－21.

［6］ Wang Y，Han C，Lu L，et al.Hedgehog signaling pathway regulates autophagy in human hepatocellular carcinoma cells［J］.Hepatology，2013，58（3）：995－1010.

［7］ Archer T C，Weeraratne SD，Pomeroy SL.Hedgehog-GLI pathway in medulloblastoma［J］.J Clin Oncol，2012，30（17）：2154－6.

［8］ Chaudary N，Pintilie M，Hedley D，et al.Hedgehog pathway signaling in cervical carcinoma and outcome after chemoradiation［J］.Cancer，2012，118（12）：3105－15.

［9］ Hammond K L，Whitfield T T.Expression of zebrafish hip：response to Hedgehog signalling，comparison with ptc1 expression，and possible role in otic patterning［J］.Gene Expr Patterns，2009，9（6）：391－6.

［10］Dennler S，AndréJ，Verrecchia F，et al.Cloning of the human GLI2 Promoter：transcriptional activation by transforming growth factor-beta via SMAD3／beta-catenin cooperation［J］.J Biol Chem，2009，284（46）：31523－31.

［11］Katoh Y，Katoh M.Hedgehog target genes：mechanisms of carcinogenesis induced by aberrant hedgehog signaling activation［J］.Curr Mol Med，2009，9（7）：873－86.

［12］Fernandez C，Tatard V M，Bertrand N，et al.Differential modulation of Sonic-hedgehog-induced cerebellar granule cell precursor proliferation by the IGF signaling network［J］.Dev Neurosci，2010，32（1）：59－70.

［13］Götschel F，Berg D，Gruber W，et al.Synergism between Hedgehog-GLI and EGFR signaling in Hedgehog-responsive human medulloblastoma cells induces downregulation of canonical Hedgehog-target genes and stabilized expression of GLI1［J］.PLoSOne，2013，8（6）：e65403.

［14］Jeng K S，Huang C C，Chu S H，et al.Factors affecting the regeneration of liver graft after living related liver transplantation：a preliminary study［J］.Transplant Proc，2013，45（4）：1354－9.

［15］Kleiner D E，Chalasani N P，Lee WM，et al.Hepatic histological findings in suspected drug-induced liver injury：Systematic evaluation and clinical associations［J］.Hepatol，2014，59（2）：661－70.

［16］Wynn T A.Cellular and molecular mechanisms of fibrosis［J］.J Pathol，2008，214（2）：199－210.

［17］Omenetti A，Yang L，Li Y X，et al.Hedgehog-mediated mesenchymal-epithelial interactions modulate hepatic response to bile duct ligation［J］.Lab Invest，2007，87（5）：499－514.

［18］Fleig S V，Choi S S，Yang L，et al.Hepatic accumulation of Hedgehog-reactive progenitors increases with severity of fatty liver damage in mice［J］.Lab Invest，2007，87（12）：1227－39.

［19］Ochoa B，Syn WK，Delgado I，et al.Hedgehog signaling is critical for normal liver regeneration after partial hepatectomy in mice［J］.Hepatol，2010，51（5）：1712－23.

［20］Syn W K，Jung Y，Omenetti A，et al.Hedgehog-mediated epithelial-to-mesenchymal transition and fibrogenic repair in nonalcoholic fatty liver disease［J］.Gastroenterol，2009，137（4）：1478－88.

［21］Swiderska-Syn M，Suzuki A，Guy C D，et al.Hedgehog pathway and pediatric nonalcoholic fatty liver disease［J］.Hepatol，2013，57（5）：1814－25.

［22］Omenetti A，Porrello A，Jung Y，et al.Hedgehog signaling regulates epithelial-mesenchymal transition during biliary fibrosis in rodents and humans［J］.JClin Invest，2008，118（10）：3331－42.

［23］Jung Y，Brown K D，Witek R P，et al.Accumulation of hedgehogresponsive progenitors parallels alcoholic liver disease severity in mice and humans［J］.Gastroenterol，2008，134（5）：1532－43.

［24］Pereira Tde A，Witek R P，Syn W K，et al.Viral factors induce Hedgehog pathway activation in humans with viral hepatitis，cirrhosis，and hepatocellular carcinoma［J］.Lab Invest，2010，90（12）：1690－703.

［25］Pazzaglia S，Cifaldi L，Saran A，et al.Hedgehog／hyaluronic acid interaction network in nonalcoholic fatty liver disease，fibrosis，and hepatocellular carcinoma［J］.Hepatol，2012，56（4）：1589.

［26］Ding H，Zhou D，Hao S，et al.Sonic hedgehog signaling mediates epithelial-mesenchymal communication and promotes renal fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2012，23（5）：801－13.

［27］Acloque H，Adams M S，Fishwick K，et al.Epithelial-mesenchymal transitions：the importance of changing cell state in development and disease［J］.J Clin Invest，2009，119（6）：1438－49.

［28］Choi SS，Omenetti A，Witek R P，et al.Hedgehog pathway activation and epithelial-to-mesenchymal transitions during myofibroblastic transformation of rat hepatic cells in culture and cirrhosis［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2009，297（6）：G1093－106.

［29］Omenetti A，Syn W K，Jung Y，et al.Repair-related activation of hedgehog signaling promotes cholangiocyte chemokine production［J］.Hepatol，2009，50（2）：518－27.

［30］Syn W K，Agboola K M，Swiderska M，et al.NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease［J］.Gut，2012，61（9）：1323－9.

［31］Philips G M，Chan I S，Swiderska M，et al.Hedgehog signaling antagonist promotes regression of both liver fibrosis and hepatocellular carcinoma in a murine model of primary liver cancer［J］.PLoSOne，2011，6（9）：e23943.

［32］Friedman S L.Mechanisms of hepatic fibrogenesis［J］.Gastroenterol，2008，134（6）：1655－69.

［33］Vokes SA，Yatskievych T A，Heimark R L，et al.Hedgehog signaling isessential for endothelial tubeformation during vasculogenesis［J］.Development，2004，131（17）：4371－80.

［34］Dohle E，Fuchs S，Kolbe M，et al.Comparative study assessing effects of sonic hedgehog and VEGF in a human co-culture model for bone vascularisation strategies［J］.Eur Cell Mater，2011，21：144－56.

［35］Witek RP，Yang L，Liu R，et al.Liver cell-derived microparticles activate hedgehog signaling and alter gene expression in hepatic endothelial cells［J］.Gastroenterol，2009，136（1）：320－30.

［36］Furubo S，Sato Y，Harada K，Nakanuma Y.Roles of myofibroblasts and notch and hedgehog signaling pathways in the formation of intrahepatic bile duct lesions in polycystic kidney rats［J］.Pediatr Dev Pathol，2013，16（3）：177－90.

［37］Hines I N，Rippe R A.Role of hedgehog signalling in bile ductular cells［J］.Gut，2008，57（9）：1198－9.

［38］Kurita S，Mott J L，Almada L L，et al.GLI3-dependent repression of DR4 mediates hedgehog antagonism of TRAIL-induced apoptosis［J］.Oncogene，2010，29（34）：4848－58.

［39］Sun H J，Liu Y J，Li N，et al.Sublocalization of Rab23，a mediator of Sonic hedgehog signaling pathway，in hepatocellular carcinoma cell lines［J］.Mol Med Rep，2012，6（6）：1276－80.

［40］Wang S，Lee Y，Kim J，et al.Potential role of hedgehog pathway in liver response to radiation［J］.PLoS One，2013，8（9）：e74141.