C-PC抑制ox-LDL诱导内皮细胞脂质过氧化损伤的机制研究

2014-05-14褚现明孙雪霞徐庆科

中国药理学通报 2014年4期

褚现明，王妮，孙雪霞，李冰，安毅，徐庆科

氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）是诱导动脉血管内皮细胞凋亡的重要因素［3］，内皮细胞保护是动脉粥样硬化防治的关键环节［1－3］。研究提示天然海洋药物——螺旋藻藻蓝蛋白（C-Phycocyanin，C-PC）具有独特的抗动脉粥样硬化疗效［4－5］，因此本研究旨在构建血管内皮细胞损伤模型，探讨C-PC在血管内皮细胞脂质过氧化损伤中所起的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料藻蓝蛋白由本课题组提取纯化（纯度为A620nm／A280nm＝4.71）［6］；♂Wista小鼠（100 g，4周龄）。LDL购自美国Chemicon公司。DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、SOD检测试剂盒、N0检测试剂盒、MDA检测试剂盒、ET放射免疫药盒（Sigma）。311型 CO2孵箱（Forma）；高速低温冷冻离心机3K30型（美国PE）；紫外分光光度计（日本岛津）。VIDAS计算机图像分析系统，OLYMPUS倒置相差显微镜。

1.2 原代小鼠血管内皮细胞的培养取小鼠胸主动脉，植块法在含20%胎牛血清的DMEM培养液中培养。倒置相差显微镜观察细胞形态和生长特征，免疫细胞化学方法进行血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原（von Willebrand factor，vWF）鉴定。试验用2－4代细胞，细胞均处于对数生长期。

1.3 实验分组和药物干预甲基四唑蓝（MTT）比色法检测细胞活性、筛选药物剂量，选取低于10%的内皮细胞生长受抑制（IC10）的C-PC浓度进行药物干预。分组：正常对照组、ox-LDL组、ox-LDL＋C-PC组。对数生长期的内皮细胞（2×107·L－1），接种于96孔板中，每孔 200μl。各组于37℃ 5%CO2孵箱内培养12 h。然后ox-LDL组、C-PC组用含有ox-LDL的培养液继续培养，24 h后进行检测。

1.4 ox-LDL诱导动脉内皮细胞脂质过氧化损伤和凋亡LDL氧化修饰和鉴定［7］，获取ox-LDL用于诱导培养内皮细胞凋亡，25%的细胞生长受抑制所需要的ox-LDL浓度，约为20 mg·L－1。

1.5 单核细胞（HL60）黏附计数法测定内皮细胞黏附性 96孔板，内皮细胞接种并培养至融合，不同浓度的C-PC预孵12 h，然后加入终浓度为0.1 g·L－1的ox-LDL继续培养24 h，倾去培养液。每孔加入109·L－1的 HL60细胞，37℃，2 h后洗去未黏附细胞，观察并计算各组HL60黏附内皮细胞数。

1.6 ox-LDL诱导内皮细胞脂质过氧化损伤的指标测定分别采用黄嘌呤氧化酶法、亚硝酸还原酶法、硫代巴比妥酸法、放射免疫法，测定细胞培养液中超氧化物歧化酶（SOD）活性、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）含量、内皮素（ET）含量。

1.7 统计学分析用SPSS 17.0进行t检验、方差分析，数据以¯x±s表示。

2 结果

2.1 ox-LDL诱导动脉内皮细胞凋亡低于细胞生长抑制率≤10%（IC10）的 C-PC药物浓度：C-PC＜80μmol·L－1。选取药物干预浓度 20、40、60、80μmol·L－1。

正常内皮细胞为扁平多角形，细胞间连接致密，呈连续排列的单层，核圆形或椭圆形、清晰，核仁1～2个。ox-LDL损伤后，细胞收缩变圆，细胞间隙明显增宽，部分细胞脱落。ox-LDL＋C-PC干预组形态异常和脱落细胞减少，最佳C-PC干预浓度为80μmol·L－1。

2.2 C-PC对培养的内皮细胞黏附性的影响（Tab 1） ox-LDL＋C-PC组黏附的HL60细胞数均较 ox-LDL组减少，80 μmol·L－1C-PC组的黏附数仅为ox-LDL组的59.4%（P＜0.01）。

Tab 1 Effect of C-PC on endothelial cell adhension（n＝6）

2.3 各组SOD活性、NO、MDA及ET含量的变化（Tab 2）ox-LDL组与正常对照组比较，细胞培养液中SOD活性、NO含量明显降低、MDA、ET含量明显升高。ox-LDL＋C-PC组80μmol·L－1与ox-LDL组相比，SOD活性、NO含量分别增加193%和203%，MDA、ET含量分别下降49%和74%。线性相关分析显示SOD活性、NO含量与C-PC呈剂量正相关（r＝0.97，0.96，P＜0.01）；MDA、ET含量与 C-PC呈剂量负相关（r＝－0.908，－0.916，P＜0.05）。

3 讨论

螺旋藻富含藻蓝蛋白（C-PC），含量达60～70%。分离纯化的C-PC具有水溶性、安全、无毒的特点［6］，研究表明，CPC具有调节血脂、抑制血管损伤后的平滑肌细胞的过度增殖、抗肿瘤增殖的作用［5，8］。

ox-LDL是内皮细胞损伤的关键因素之一，促进内皮细胞及单核细胞分泌黏附分子，使单核细胞易于黏附。内皮细胞所具有的抗氧化机制如SOD可清除活性氧，SOD活性降低，氧自由基生成增加，氧化细胞膜双层磷脂结构中的重要脂类，生成多种脂质过氧化物，使得培养液中MDA含量增高，MDA为脂质过氧化反应的中间产物，常被作为观察活性氧生成和膜损害的指标［9］。NO和ET的动态平衡，最终决定了血管的舒缩和平滑肌细胞的有丝分裂状态。缺氧可使内皮细胞合成NO，而ET mRNA表达的增加；SOD可减轻ET对鼠骨骼肌缺血／再灌注损伤的加剧［9］。

本研究结果提示，C-PC抑制ox-LDL诱导内皮细胞脂质过氧化损伤，可能的机制：（1）提高SOD活性，减少活性氧生成，MDA生成减少；（2）使NO产生增多、减少ET生成，有助于改善血管舒张功能；（3）抑制脂质过氧化损伤，抑制单核细胞的黏附。但深入的机制研究有待明确，如可能与减低NO的氧化失活、激活eNOS、提高NO生物利用度、影响ETmRNA水平及转录有关，这还有待于进一步的深入研究。

参考文献：

［1］ Tang-Feldman Y J，Lochhead S R，Lochhead G R，et al.Murine cytomegalovirus（MCMV）infection upregulates p38 MAP kinase in aortas of Apo E KO mice：a molecular mechanism for MCMV-induced acceleration of atherosclerosis［J］.J Cardiovasc Transl Res，2013，6（1）：54－64.

［2］ Chu X M，An Y，Li B，et al.The progression of the relation between inflammation and atherosclerosis［R］.Mol Cardiol China，2010，11：184－8.

［3］ Miyazaki T，Taketomi Y，Takimoto M，et al.m-Calpain induction in vascular endothelial cells on human and mouse atheromas and its roles in VE-cadherin disorganization and atherosclerosis［J］.Circulation，2011，124：2522－32.

［4］ Li B，Chu X M，Gao M H，et al.Apoptotic mechanism of MCF-7 breast cells in vivo and in vitro induced by photodynamic therapy with C-phycocyanin［J］.A cta Biochim Biophys Sin，2010，42：80－9.

［5］褚现明，冷敏，安毅，等.藻蓝蛋白抑制血管平滑肌细胞过度增殖性管腔狭窄的机制研究［J］.中国药理学通报，2012，28（10）：1383－8.

［5］ Chu X M，Leng M，Li Y，et al.Mechanism of inhibitory effects of C-phycocyanin on over proliferation of vascular smooth muscle cells and luminal stenosis［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（10）：1383－8.

［6］ Li B，Zhang X C，Gao M H，et al.New research on extraction and purification of phycocyanin from Spirulina platensis［J］.Marine Sci，2007，31（8）：48－52.

［7］ Wang Y J，Wen M，Pang SQ.The oreparation of oxidized low density lipoprotein（ox-LDL）［J］.J Capital Med Univ，1996，17（1）：32－5.

［8］李冰，褚现明，高美华，等.藻蓝蛋白介导光动力疗法在乳腺癌治疗中的机制研究［J］.中国药理学通报，2011，27（3）：383－9.

［8］ Li B，Chu X M，Gao M H，et al.Study on the mechanism of C-phycocyanin mediated photodynamic therapy in curing mice with MCF-7［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（3）：383－9.

［9］ Yu S，Wong SL，Lau C W，et al.Oxidized LDL at low concentration promotes in vitro angiogenesis and activates nitric oxide synthase through PI3K／Akt／eNOSpathway in human coronary artery endothelial cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，407（1）：44－8.