刚地弓形虫类枯草杆菌蛋白酶的研究进展

郑 斌，尹志奎

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii, Tg)为专性细胞内寄生原虫，可主动侵入多种动物的有核细胞，导致弓形虫感染或人兽共患弓形虫病。对于美国和法国来说，弓形虫已成为继沙门菌(Salmonella)和李斯特菌(Listeria)后的第三大食源性致死性病原体[1]。

微线体蛋白(microneme proteins, MICs)[2]、棒状体蛋白(rhoptry proteins, ROPs)[3]及致密颗粒蛋白(dense granules proteins, GRAs)[4]等多种蛋白都参与了弓形虫粘附、入侵和发育的过程。其中大多数蛋白必需经蛋白酶修饰或加工后，功能域展现或活性位点形成，蛋白才得以发挥其功用。类枯草杆菌蛋白酶(subtilisin-like protease, SUB)就是其中的蛋白酶之一，属于丝氨酸蛋白酶家族的一种。最早发现的顶复门寄生虫(弓形虫、疟原虫和隐孢子虫等)的SUB为恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum, Pf)的PfSUB1 和 PfSUB2[5-6]。PfSUB1有多个作用底物，是恶性疟的必需蛋白酶，也是一个潜在的抗疟药物靶点[7-10]。PfSUB2是一个促进恶性疟裂殖子表面蛋白1(merozoite surface protein 1, MSP-1)成熟的成熟酶[6]。SUB在顶复门寄生虫的生物学中发挥着重要作用[11-12]。

1 刚地弓形虫类枯草杆菌蛋白酶1(TgSUB1)

1.1蛋白结构与特性

1.1.1TgSUB1的结构 Miller等[13]用PfSUB1(GenBank CAA05261)的催化区域序列[5]对弓形虫EST文库(ParaDB.cis.upenn.edu/toxo/index.html)进行BLAST和模序搜索，得到弓形虫的相似DNA片段TgESTzy93h10.r1。设计引物，从弓形虫RH株的λZAPII cDNA文库中扩增出2 241 bp片段，但未包含起始密码。利用5′ RACE(Rapid amplification of cDNA ends)扩增全长基因，命名为TgSUB1。根据基因的开放读码框(open reading frame, ORF)预测TgSUB1蛋白包含信号肽(signal peptide)、prodomain、催化区(catalytic domain)和富含脯氨酸(proline-rich)的C端。

TgSUB1(GenBank AY043483)蛋白含795个氨基酸残基(amino acid residue, aa)，分子量84 916 Da，等电点为5.15。在第23aa Gly(Gly23)后有一个预测的信号肽酶酶切位点；氨基酸序列中有与其它生物SUB相似的催化三联征Asp259、His315和Ser490及oxyanion hole residue Asn407；C端为富含脯氨酸序列TPP(S/C)APSP(P/S)P(P/R)。新孢子虫(Neosporacaninum, Nc)的SUB1(NcSUB1, GenBank AAF04257)也含有此序列，但两者在基本序列和重复片段上有明显差异[14]。无跨膜区；在Ser769处有一潜在的糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol, GPI)锚着位点。与其它生物的SUB相比，TgSUB1与NcSUB1最相似，相似率达66%，同PfSUB1、PfSUB2 和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的BPN′相似率分别为40%、32%和33%。催化区域的氨基酸高度保守。

1.1.2TgSUB1定位于微线体 利用PfSUB1抗血清(能识别TgSUB1)对TgSUB1进行免疫荧光定位，结果显示荧光标签位于虫体的一极；免疫电镜下TgSUB1和MIC2共定位于微线体[13]。TgSUB1与MIC相似，以钙离子依赖的方式从虫体的微线体分泌。

Binder等[15]分别采用GRA1、ROP1和微线体蛋白2相关蛋白(MIC2 associated protein, M2AP)的启动子表达TgSUB1，Western blot结果表明GRA1、ROP1启动子启动下TgSUB1有较高的表达水平；免疫荧光定位显示GRA1启动子下表达的TgSUB1定位于纳虫泡(parasitophorous vacuole, PV)和虫体表面；ROP1启动子下TgSUB1一部分定位于微线体，一部分可达虫体表面；M2AP启动子下TgSUB1定位于微线体。该结果提示TgSUB1定位于微线体是启动子特异性的。

将血凝素(hemagglutinin, HA)标签插入TgSUB1 prodomain基因的不同区域，诱导表达蛋白。结果显示大部分TgSUB1产物被正确加工为小分子形式，且定位于微线体；当HA标签插入prodomain区域使其加工过程不完全时，则TgSUB1不能有效的定位于微线体，大量堆积于分泌途径上。由此判断TgSUB1 prodomain的加工对于TgSUB1的定位非常重要[15]。

为确定TgSUB1的不同区域对该蛋白定位的影响，Binder等[15]构建了前肽(propeptide)、催化区域、富含脯氨酸区域和GPI anchor分别缺失的虫株。免疫荧光定位分别显示催化区域、富含脯氨酸区域和GPI anchor的缺失并不影响TgSUB1定位于微线体，而前肽缺失株的TgSUB1则滞留于虫体胞核的周围，因此TgSUB1前肽对于TgSUB1在微线体的定位是必须的。

将TgSUB1前肽序列与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)、表面蛋白1(surface antigen 1, SAG1)分别构建异构重组体，免疫荧光定位显示GFP、SAG1均可定位于微线体，提示前肽序列中可能含有微线体定位信号肽；将仅含前肽序列的肽段免疫荧光定位，结果显示该前肽滞留于内质网，并未到达微线体，提示前肽序列的氨基酸的折叠信息对于前肽功能是必须的[15]。

1.1.3TgSUB1通过GPI锚着与虫体胞膜连接 氨基酸序列分析显示TgSUB1有一个GPI锚着的加入位点[13]。Binder等[15]用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(phosphatidylinositol-specific phospholipase C, PI-PLC)处理虫体，裂解液经Triton X-114抽提，TgSUB1产物出现在水相部分，提示TgSUB1的GPI部分已被PI-PLC切去，因为其余部分为水溶性的，因此TgSUB1产物在水相部分出现。

含3H的氨基乙醇(ethanolamine)和软脂酸酯(palmitate)可以标记GPI锚着蛋白SAG1、SAG3和SAG4，其中3H氨基乙醇是通过GPI anchor来标记蛋白，而软脂酸酯则通过硫酯(thioester)的联接来标记蛋白。PfSUB1抗体识别的免疫共沉淀产物中的TgSUB1能被3H的氨基乙醇和软脂酸酯标记，提示TgSUB1通过GPI锚着与虫体胞膜连接。

1.2TgSUB1的功能

1.2.1TgSUB1对多种功能蛋白的酶解加工作用 Miller等[13]的研究发现TgSUB1连续被加工，从120 kDa到90 kDa、82 kDa至70 kDa、47 kDa、直至44 kDa蛋白片段，丝氨酸蛋白酶抑制剂brefeldin A可阻止TgSUB1的第二次加工(由90 kDa到82 kDa)，提示TgSUB1可能具有自身修饰功能。

在正常情况下，M2AP被加工为M2AP1～4 4个蛋白片段[16]；MIC4(72 kDa)的N端先被剪切产生一个70 kDa的分子，然后其C端被加工产生50 kDa 和15 kDa的产物[16-18]。在SUB1缺失(△sub1)的弓形虫株分泌产物中检测不到 MIC4 50 kDa和M2AP1～4。同样，野生株的MIC2在正常情况下其N端被切去一个5 kDa的蛋白片段，但△sub1虫株的MIC2的分子量较大，提示其未被加工[19]。

为进一步分析TgSUB1的潜在作用底物，Lagal等[19]用双向差异凝胶电泳(two-dimensional differential gel electrophoresis, 2D-DIGE)对△sub1虫株排泄分泌抗原(excreted-secreted antigen, ESA)进行蛋白组学分析，结果显示：1)未观察到TgSUB1的80 kDa、70 kDa、40 kDa及TgSUB1 prodomain蛋白片段；2)MIC2 95～90 kDa蛋白片段、M2AP1～4蛋白片段、MIC4 50 kDa和15 kDa产物的量减少；3)M2AP成熟体和MIC4 72 kDa precursor的量增加；4)MIC1、MIC3和GRA7等蛋白的丰度增加。这些结果提示△sub1虫株中多种蛋白的加工与野生株不同。

众多研究表明弓形虫的出胞(egress)过程不同于虫体入胞过程，发挥关键作用的蛋白也不同[20]。Roiko 等[21-22]认为TgSUB1有可能参与虫体出胞过程中蛋白的酶解加工。

1.2.2TgSUB1与虫体的粘附、入侵及滑移运动相关 由于弓形虫虫体表面蛋白水解加工关系到MICs的激活、虫体的粘附及入侵，因此Lagal等[19]分析了不同弓形虫株粘附、入侵宿主细胞的能力。实验结果显示△sub1虫株的粘附效率下降了30～40%，入侵效率(和宿主细胞共孵育15 min)下降了45～60%。当入侵时间的标准向后延迟设定为1 h时，△sub1虫株的入侵程度与对照虫株相当，提示△sub1虫株对宿主细胞的入侵为延缓入侵，这种现象在M2AP缺陷株的入侵中同样存在[23]。因此，TgSUB1的缺失削弱了速殖子的粘附和入侵效率[19]。

弓形虫速殖子有3种运动方式：螺旋运动(helical)、环状运动(circular)及快速转动(twirling)[24]。将△sub1虫株滴加在FBS包被的盖玻片上，活体视频显微镜(live video microscopy)下未能观察到其滑移运动踪迹，而补充了全长SUB1的△sub1虫株则可呈现出相应的踪迹，提示△sub1虫株的滑移运动(gliding motility)存在缺陷。

1.2.3TgSUB1与虫体的毒力相关 将10-1 000个虫株(△sub1株和对照株)由腹腔途径感染小鼠，小鼠死亡的时间无明显差异。250个虫体由静脉途径感染小鼠，对照株感染小鼠的死亡时间为10 d，而△sub1株感染小鼠的死亡时间为14～15 d，提示在小鼠动物模型上，TgSUB1的表达对于弓形虫毒力是必须的[19]。

1.2.4TgSUB1的活性及酶解加工特性受TgMIC5的抑制 Brydges等[25]发现TgMIC5可抑制TgSUB1的活性，推测其机制为：1)TgMIC5直接与TgSUB1联接，并占据其活性位点；2)TgMIC5与TgSUB1的作用底物相连，从而保护底物免受TgSUB1的过度作用(因为TgMIC5与任何蛋白抑制剂无氨基酸序列相似性)。Saouros等[1]利用核磁共振分光术(nuclear magnetic resonance spectroscopy)发现TgMIC5的三维结构与TgSUB1 prodomain相似，其C端弹性肽可插入TgSUB1的活性位点，从而抑制该蛋白的活性。不仅TgSUB1的活性受MIC5抑制，TgSUB1自身的修饰及TgSUB1对TgMIC4、TgMIC2、TgM2AP和穿孔素样蛋白1(perforin-like protein 1, PLP1)的加工也被抑制。也正是由于与膜锚着蛋白TgSUB1的直接相互作用，TgMIC5才得以滞留于虫体胞膜上。

1.2.5TgSUB1为弓形虫病诊断抗原的候选分子 Hruzik等[26]利用双向电泳对弓形虫裂解液进行筛选，质谱分析差异位点，结果提示TgSUB1为一潜在的急性弓形虫病诊断抗原。在体外利用原核表达系统制备TgSUB1 C端蛋白片段，约24.7 kDa，以空质粒菌做对照，分别与29份未感染血清、23份急性弓形虫病患者血清和28份慢性或隐性感染者血清进行线性点杂交实验(Line blot assay)，结果显示TgSUB1可以很好地与急性感染血清中的IgA、IgM和IgG反应，提示TgSUB1为弓形虫病诊断抗原的候选分子之一。

2 刚地弓形虫类枯草杆菌蛋白酶2(TgSUB2)

2.1蛋白结构与特性

2.1.1TgSUB2的结构 Miller等[27]以已知的恶性疟原虫的PfSUB1设计同源引物，PCR扩增TgSUB2。TgSUB2(GenBank AF420596)基因ORF全长3 903bp，1 300个aa，包含有信号肽、跨膜区和催化三联征D783、H836、S999和 oxyanion hole N931。TgSUB2和其它SUB有300个aa(包括蛋白催化区域)非常相似。在催化区域，TgSUB2与PfSUB2的相似度较高(35%)，与TgSUB1、NcSUB1有30%相似。TgSUB2有一个钙连接环(calcium-binding loop)N849-V853，提示该蛋白并非蛋白酶K家族成员。TgSUB2为I 型跨膜蛋白。

2.1.2TgSUB2与TgSUB1为两个不同的蛋白 免疫共沉淀实验发现能识别TgSUB1的PfSUB1抗体不能与TgSUB2的沉淀物发生明显反应，仅在90 kDa处有弱的蛋白条带。提示TgSUB1和TgSUB2为弓形虫速殖子的两个截然不同的蛋白，且两蛋白仅有很小的交叉反应性。

2.1.3TgSUB2为虫体的必须蛋白 为观察TgSUB2基因断裂后对弓形虫入侵的影响，Miller等[27]试图制备TgSUB2基因断裂株，无论是氯霉素乙酰转移酶(chloramphenical acetyl transferase, CAT)筛选标记还是次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶(hypoxanthine xanthine guanine phosphoribosyl transferase, HXGPRT)体系，200多个克隆均未得到TgSUB2基因断裂株，提示TgSUB2基因为速殖子的必需基因，一旦基因断裂，TgSUB2蛋白缺失，虫体不能存活。

2.1.4TgSUB2定位于棒状体 Miller等[27]用TgSUB2抗体Western blot分析弓形虫速殖子ESA，结果发现在微线体及致密颗粒胞器分泌的蛋白中检测不到TgSUB2。免疫电镜下兔源性抗体识别的TgSUB2分布于棒状体的球部，与小鼠源性单克隆抗体Tg49识别的TgROP1共定位于棒状体。与PfSUB2不同，PfSUB2定位于裂殖子(merozoite)的致密颗粒胞器[6]。

2.2TgSUB2的功能

2.2.1TgSUB2对其自身、TgROP1进行加工 在TgSUB2 C端加一个HA标签，E686突变为R，S999突变为A，分别制备TgSUB2-HA、TgSUB2-HA E686R和TgSUB2-HA S999A重组体，转染入表达系统，TgSUB2抗体和HA抗体Western blot分析表达产物。在TgSUB2-HA的表达产物中可以检测到三个蛋白条带：140 kDa、90 kDa和85 kDa，而在TgSUB2-HA E686R和TgSUB2-HA S999A的表达产物中，TgSUB2抗体可以检测到三个蛋白条带，HA抗体只检测到两个蛋白条带：140 kDa和85 kDa，该结果提示TgSUB2对其自身有加工作用，且该作用发生在蛋白的N端，作用位点为E686；S999为TgSUB2的活性位点之一，一旦突变，TgSUB2的活性受到影响[27]。

疟原虫ROP多组装为大的复合体，才能被正确运输至棒状体胞器。弓形虫的多数ROP也经历相同的加工过程。TgROP1的剪切位点E83突变后，TgROP1的加工受到抑制。分析TgSUB2和TgROP1的蛋白序列，两者有相似的剪切位点，提示TgSUB2有可能参与TgROP1的加工[27]。

2.2.2TgSUB2与TgROP1相联接 TgSUB2可以和弓形虫裂解液中的部分TgROP1共同出现在免疫共沉淀产物中，提示TgSUB2和TgROP1相联接[27]。而且，与TgSUB2联接的是TgROP1的成熟体，非TgROP1前体，该发现支持TgSUB2对TgROP1有加工作用的推测。Kim等[28]认为既然TgSUB2对TgROP1加工后，能使其由前体转变为成熟体，则TgSUB2为TgROP1的成熟酶(maturase)。与ROP2、ROP4不同，TgSUB2不具有棒状体定向序列YXXF或NYXP，该蛋白之所以定位于棒状体，可能与它和ROP1的联接作用相关。

3 结 语

TgSUB1和TgSUB2参与弓形虫的粘附、入侵和运动，并影响虫株的毒力；PfSUB1、PfSUB2和PfSUB3[29]在虫体入侵及发育过程中发挥作用，且PfSUB1还是一个潜在的抗疟药物靶点；微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum, Cp)的SUB1在虫体感染细胞时发挥作用，也有可能作为一个潜在的药物靶点[30]。随着顶复门寄生虫SUB的广泛深入研究，有助于发现更多TgSUB及它们在弓形虫生物学中的更多作用，有可能发现合适的药物靶点，从而有效预防弓形虫感染和弓形虫病。

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