肠道病毒71型研究进展

翁育伟(综述)，严延生(审校)

肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)是引起儿童手足口病(Hand foot mouth disease，HFMD)的主要病原体，病毒感染后的临床表现包括无症状感染以及以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为特征的HFMD，少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别患者病情进展迅速，可导致死亡。在HFMD患者中，EV71感染是造成重症和死亡的主要危险因素之一。EV71最早发现于1969年，上世纪70-80年代，该病毒主要以散发形式流行于美洲及欧洲等国家，欧洲个别国家曾有暴发流行。1997年后EV71开始在亚洲持续发生暴发流行并不断扩散，目前已经成为亚太地区的重要公共卫生问题，对本地区儿童健康造成严重影响。为应对和控制EV71的流行，近年来各国在EV71的防控上投入了大量的资源并取得了显著的进展。本文就目前在EV71的流行病学、病毒受体研究、抗病毒治疗以及疫苗发展等方面取得的进展进行总结。

1 病毒学

在病毒分类上，EV71属于小RNA病毒科(picoraviridae)肠道病毒属(enterovirusgenus)成员，病毒的形态为无包膜正二十面体结构，大小约为33-35nm[1]，基因组为一长约7.4 kb的单正链RNA分子，其5’末端与病毒的Vpg蛋白共价结合，形成非帽子结构的5’末端。病毒基因组从5’端到3’端分别为5’ 端非编码区、蛋白编码区和3’ 端非编码区。其中5’端非编码区含有控制病毒复制和蛋白翻译的重要元件，3’端非编码区含有多聚腺苷酸尾，两者之间具有单一的长的开放阅读框，编码病毒多聚蛋白。病毒基因组RNA可以作为mRNA模板，用于病毒多聚蛋白的合成。病毒进入宿主细胞后，宿主细胞转录起始因子与 5’端的内部核糖体进入位点(Internal ribosomal entry site, IRES)结合，启动病毒多聚蛋白的翻译。合成的多聚蛋白在病毒自身蛋白酶(2Apro，3Cpro)的作用下，水解成为4种结构蛋白(VP1-4)和7种非结构蛋白(2A-2C，3A-3D)。VP1-4结构蛋白构成病毒的基本的衣壳结构单位(protomer)，其中VP1-3暴露于病毒表面，而VP4蛋白则包埋于病毒内部。病毒VP1蛋白表面具有重要的细胞受体结合位点[2-3]，以及中和抗体表位[4]。病毒的复制在细胞质内完成，在复制过程中，基因组RNA可作为模板，用于转录产生负链RNA分子，再以负链RNA为模板合成子代RNA。基因组复制完成后，病毒在细胞内完成子代病毒的装配并以裂解的方式释放到细胞外。

2 流行病学

EV71最早是1969年从美国1例9月龄脑炎儿童病例标本中分离[5]。上世纪70-80年代，EV71仅在欧美、澳大利亚等地流行，除局部暴发以外，主要以低水平流行。1970年代，欧洲暴发了两次大的EV71流行，1975年保加利亚[6]、1978年匈牙利[7]先后暴发了EV71流行，分别报告705例和1 550例病例，并造成44和47例亡。进入90年代后，亚洲成为EV71的主要流行地区。1997年，马来西亚的沙捞越地区暴发EV71引起的手足口病[8]，报告发病约13万例。1998年台湾暴发了EV71引起的手足口病大流行[9]，在报告的近13万病例中，重症405例，死亡78例。此后EV71即在台湾长期流行。2010年，新加坡暴发了该国有史以来最大的手足口病流行，在报告的3 790例病例中有73%的病例由EV71感染造成[10]。在我国，自1998年起就有EV71的流行，但2007年之前仅以散发为主。2007年山东临沂[11]和2008年安徽阜阳[12]先后暴发了以EV71感染为主的手足口病，分别造成14例和23死亡，之后EV71在国内开始了持续的暴发流行。除了上述国家和地区外，同期亚洲其它国家也有EV71流行的报道。

EV71主要感染儿童[13]。在早期的EV71感染中，病例的临床表现主要以神经系统症状为主，如病毒性脑炎、无菌性脑膜炎等。但自1973年日本EV71暴发流行后，EV71感染的临床表现开始倾向于皮肤病变，以发热以及手、足、口腔粘膜疱疹等为主要临床表现，即手足口病。但与同样引起HFMD的其它肠道病毒相比，如CVA16等，EV71感染的临床症状更严重，尤其是在婴幼儿中[14]，更易导致神经系统症状，死亡率也更高，是造成HFMD患者重症和死亡的主要危险因素之一。EV71流行有明显的季节性特征，其主要流行季节在夏季，在我国，EV71流行的高峰除了夏季(4-6月)外，南方和中部省份9-10月左右还有一个明显的次高峰[13]。影响EV71流行的因素包括温度、湿度以及降雨等气候条件[13]以及高人口密度[15]等。在感染者个体因素方面，有研究表明白细胞抗原HLA-A33和EV71的易感性高度相关，HLA-A33是亚洲人常见的表型，而白种人中少见，这可能是亚洲的EV71流行较欧美严重[16]的原因。

EV71的进化[17]导致众多的基因型(genotype)和基因亚型(sub-genotype)的出现，基于病毒序列分析的分子分型方法[18]已被普遍接受。根据VP1核苷酸序列的差异，EV71分为A-C等3个基因型[19]。其中，A基因型仅有一个成员即EV71的原型(BrCr)株，而B和C基因型又可进一步分为B1-5、C1-5各5种基因亚型。1985年以前发现的EV71多为B基因型(B1和B2)，C基因型病毒则在1985年之后出现[19]，其中，C3和C5分别局限在韩国和越南[17]。从全球看，目前欧美等国家主要流行C1和C2亚型病毒，而在亚太地区，则呈现B3-5、C1-2、C4等多种基因亚型病毒共同循环的局面。在我国，1998年至今主要流行的病毒为C4亚型，但2004年之前以C4b为主，而2004年之后则以C4a为主[20]。在台湾，1986到2008年期间至少发生了3次的EV71病毒的基因型转换[22]。病毒基因型的转换有利于病毒逃脱人群免疫压力，进而在人群中扩散，因此病毒基因亚型的频繁转换可能是导致亚太地区手足口病周期性暴发的原因[21]。除此以外，病毒之间的重组[23]也使得手足口病的流行和致病性等特征进一步复杂化。

3 病毒受体

EV71可以通过粪-口、呼吸道、接触等多种途径传播。病毒进入宿主后，首先在扁桃体、派氏淋巴结等处进行复制，随后经外周淋巴结，产生病毒血症，多数病例在该时期即可控制病毒在体内的进一步弥散和临床进展。在病毒感染过程中，病毒与特异性受体的结合是启动EV71病毒感染和细胞内复制的关键步骤。

近几年，EV71受体的相关研究取得了重大突破。首先是Yang等的研究[24]表明，EV71受体可能是一类O型链接的唾液酸化(sialylated glycan)糖蛋白或糖脂。破坏DLD-1肠道上皮细胞表面O链接的唾液酸化多糖(SA-linked O-glycan)可以抑制EV71病毒的感染，因此作者推测EV71受体可能是一类唾液酸化多糖。但最近的研究表明此类受体可能是一类吸附性受体[25]。

2009年Nishimura等人[3]证实了P选择素配体1糖蛋白(P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1，CD162)是EV71的一种功能性受体，该受体主要分布在淋巴细胞表面，其N末端42-61aa是与EV71相互作用的关键部位。EV71病毒与PSGL-1结合可介导病毒感染。但神经细胞表面普遍缺乏PSGL-1，因此该受体无法介导病毒对神经细胞的感染，同时PSGL-1也仅介导部分基因(亚)型的EV71感染。基于上述原因，推测可能还有替代途径支持EV71对神经细胞的感染，以及其它PSGL-1非依赖病毒对宿主细胞的感染。

清道夫受体B2(Scavenger receptor class B member 2，SCARB2)是一类III型双跨膜蛋白，主要分布于细胞的内体和溶酶体，同时表达在多种细胞的表面。Yamayoshi等的研究[2]证实了SCARB2是一种EV71的细胞表面受体，SCARB2可与EV71结合并介导病毒的感染，与PSGL-1不同，SCARB2可介导所有基因(亚)型病毒感染，同时还介导CVA7、10、14、16的感染。由于SCARB2在各种细胞表面普遍存在，因此，SCARB2可能是病毒在宿主体内播散的重要受体。然而研究表明[2]，尽管感染效率较低，但SCARB2缺失细胞也能部分支持EV71的感染，这种现象提示SCARB2可能并非介导EV71感染的唯一受体。

膜联蛋白II(Annexin II，Anx2)是一种细胞粘附因子，Yang等的研究[26]表明，Anx2蛋白可与EV71病毒的40-100aa结合，增强EV71病毒的感染性，表达Anx2的HepG2细胞可大幅提高部分基因亚型(C2/C5/B5)EV71的细胞表面吸附和病毒产量，但Anx2并非EV71感染所必须。树突状细胞(Dendritic cells，DC)在机体抗病毒免疫过程中具有重要的作用，EV71感染DC有利于诱导保护性免疫，在病毒感染过程中，DC细胞的DC-SIGN分子可能也部分发挥作用[27]。

上述有关病毒受体的研究成果，为今后EV71的治疗和预防相关研究提供了重要的基础，比如建立动物模型[28]、抗病毒药物的设计等。然而有研究表明，启动肠道病毒进入宿主细胞可能需要多种受体的协同作用[29]，因此，上述几种受体真正的生物学功能、相互之间的关系以及受体在介导EV71病毒进入、感染以及在疾病中的作用等机制还需要进一步研究。

4 抗病毒治疗

目前，临床上对EV71感染尚缺乏特异性的治疗手段，临床治疗仍以对症、支持治疗为主要方法，因此研制特异性抗病毒药物对EV71感染的治疗和预防控制具有重要意义。目前，针对EV71抗病毒药物研发的策略主要集中在阻断病毒进入宿主细胞、抑制病毒复制、阻断病毒蛋白合成以及调节机体抗病毒免疫等环节[30]。

中和抗体在阻断病毒感染中具有重要的作用，利用灭活病毒或VP1蛋白中和表位多肽制备中和抗体，可有效抑制病毒的感染[31]，因此，抗体药物具有较好的开发和应用前景。由于目前缺尚乏可供临床用的特异性抗体药物，因此临床上仅能使用丙种球蛋白等非特异性的抗体，用于危重病例的临床救治[32]。

小分子化合物是目前研究抗病毒药物的另一个热点，已发现有多种小分子化合物具有抗病毒活性但其抗病毒的机制各异，如pleconaril[30]等小分子化合物可通过结合VP1蛋白，干扰或阻断病毒与宿主细胞的结合；rupintrivir可通过抑制病毒3Cpro蛋白酶活性[33]阻断病毒的复制；DTriP-22则可通过作用于病毒3D蛋白，即病毒RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)抑制病毒的复制[34]。然而，尽管上述小分子化学药物具有一定的抗病毒作用，但也存在一些缺陷，例如并非所有的基因型的EV71病毒对pleconaril都敏感，因此这些化合物药物的作用机制、应用效果需进一步明确。

机体免疫调节是抗EV71治疗的另一重要手段。巨噬细胞具有杀病毒活性，研究表明移植成年鼠巨噬细胞可以有效抑制EV71在攻毒小鼠内的复制，减轻症状并降低死亡率[35]。I型干扰素(IFN)可以有效降低攻毒小鼠的死亡率，其中，IFNα14具有明显的抗病毒效应[36]，这种效应可能是IFNα14具有较强的诱导抗病毒效应分子的结果。上述结果提示，在EV71的治疗中，可能可以通过免疫调节，增强机体抗病毒免疫应答，从而达到抗病毒治疗效果。

除了上述手段外，RNA干扰、病毒多肽等一些新技术[37]也为EV71的抗病毒治疗提供了新的选择。尽管EV71的抗病毒治疗还有许多问题待解决，但目前许多基础研究所取得的成果，比如病毒受体的发现等，将为今后特异性抗病毒治疗的研究奠定了良好的基础。

5 疫 苗

疫苗是预防传染病最有效的手段。鉴于EV71感染对儿童健康造成的巨大危害，疫苗研制成为EV71防控研究的首要工作。既往曾尝试过多种形式的疫苗，包括灭活疫苗[1]、病毒样颗粒样疫苗[38]、重组VP1亚单位疫苗[39]、重组VP1 DNA疫苗、VP1多肽疫苗[31]，以及可食性的疫苗(edible Vaccine)[40]等。在上述疫苗类型中，受疫苗相关法规以及疫苗生产标准化等因素的制约，DNA疫苗和可食类疫苗短期内难以得到应用。EV71减毒活疫苗则因存在毒力返祖的潜力，也受到限制。因此，EV71疫苗研发主要集中在包括病毒样颗粒疫苗、重组VP1亚单位疫苗、多肽疫苗以及灭活疫苗在内的几种候选疫苗上，而上述疫苗也是迄今为止FDA批准的主要病毒疫苗形式。

候选疫苗是否具有应用前景，还取决于疫苗的免疫效力。台湾国立卫生研究院疫苗研发中心利用建立的标准抗原和免疫原性分析方法，比较了几种主要EV71疫苗的免疫效力[39]，结果表明，在上述几种主要的候选疫苗中，其免疫效力为：灭活疫苗>病毒样颗粒疫苗>重组VP1亚单位疫苗>多肽疫苗。因此，灭活疫苗在几种候选疫苗中最具应用前景。其它如多肽疫苗，虽具有良好的稳定性和成本效益，但从免疫效力上看，其诱导机体产生中和抗体的能力有限[31]，比如多肽VP1-43(VP1 residues 211-225)仅能诱导低滴度的中和抗体(1/32)，而多肽VP2-28(VP2 residues 136-150)则不能诱导产生中和抗体，因此其发展和应用受到限制。

由于EV71对亚太地区的危害最为严重，因此目前EV71疫苗的研发机构主要集中在亚太地区。鉴于灭活疫苗的应用前景[41]，已有中国大陆、台湾、新加坡共5家生物公司或政府机构正在研制EV71灭活疫苗。由于流行的病毒基因型(或基因亚型)不同，不同的国家在疫苗株的选择上有所不同，其中中国大陆选择C4基因型，台湾选择B4基因型，而新加坡选择B3基因型[42]。除病毒型别外，疫苗生产过程的质量控制、免疫效果的评价也是疫苗研制过程中的重要环节。目前，包括毒株筛选[43]、抗原含量检测[44]、中和抗体检测效果[45]在内的质量控制方法也已基本建立，应用上述标准对国内不同疫苗进行的免疫效果评价表明[46]，尽管采用的病毒毒株、生产工艺有所差异，但不同疫苗均可产生有效的保护性抗体。

截止目前，EV71灭活疫苗研制已经取得了重大进展，中国大陆的3家疫苗研发机构研制的EV71疫苗均已经完成3期临床实验，台湾和新加坡的两家公司的疫苗也已经完成1期临床实验。其中，从国内的一家研发机构(Vigoo)开展的一系列EV71疫苗临床实验结果表明，灭活疫苗具有良好的安全性和免疫原性，疫苗可以诱导产生高滴度的中和抗体，对EV71相关的手足口病的保护可达90%(95%CI: 67.1～96.9%)，对EV71相关的疾病保护达80.4% (95%CI 58.2～90.8%)[47]。

预计在不久的将来，商业化的EV71疫苗就可投入使用。但疫苗的应用依然会面临一些问题，例如疫苗是否可以提供不同基因型(或亚型)之间的交叉保护作用[48]等，还有待进一步评价。此外，有研究表明，亚中和滴度的抗体可以促进EV71病毒感染[49]，因此抗体的ADE(antibody dependent enhancement)效应也是今后疫苗使用中必须考虑的问题。由于CVA16病毒也是儿童HFMD的主要病原体之一，而且目前的研究表明，EV71中和抗体尚无法对CVA16提供交叉保护[50]。因此，有效预防手足口病，应当进一步研制包含EV71和CVA16等多种病毒成分在内的多价疫苗。

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