葛根通脉饮诱导血管平滑肌细胞凋亡的实验研究

陈 芳郜新莲* 沈晓君赵君玫

（1 河南省人民医院，河南 郑州 450003；2 河南中医学院，河南 郑州 450008）

葛根通脉饮诱导血管平滑肌细胞凋亡的实验研究

陈 芳1郜新莲2* 沈晓君2赵君玫2

（1 河南省人民医院，河南 郑州 450003；2 河南中医学院，河南 郑州 450008）

目的研究葛根通脉饮对同型半胱氨酸（homocysteinemia，HCY）诱导增殖大鼠血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的促凋亡作用。方法制备葛根通脉饮含药血清，大鼠VSMC原代培养、鉴定，分为空白组、HCY组、葛根通脉饮组、瑞舒伐他汀（可定）组、葛根通脉饮联合可定组。药物干预后，Annexin/PI双染法检测细胞凋亡率。结果与空白组比较，HCY组细胞凋亡率显著降低（P＜0.01）；与HCY组比较，葛根通脉饮组、可定组、葛根通脉饮联合可定组细胞凋亡率显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。结论葛根通脉饮可促进HCY诱导增殖的大鼠VSMC凋亡，可能是其抗动脉粥样硬化（atherosclerosis， AS）作用机制之一。

葛根通脉饮；同型半胱氨酸；血管平滑肌细胞；细胞凋亡

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）过度增殖是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）形成的主要病理机制之一，抑制VSMC增殖是防止AS病变发生发展、减轻血管重构的的关键[1]。本实验通过观察我院的院内制剂葛根通脉饮对同型半胱氨酸（homocysteinemia，HCY）诱导增殖大鼠VSMC的促凋亡作用，探讨其抗动脉粥样硬化的机制，为葛根通脉饮临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 葛根通脉饮和瑞舒伐他汀（可定）含药血清制备

葛根通脉饮由葛根30 g、山楂15 g、太子参12 g、当归尾6 g、淫羊藿6 g、赤芍6 g、川芎6 g、甘草6 g等组成，药材购自河南中医学院第一附属医院中药房并由制剂室制备成中药汤剂。瑞舒伐他汀（可定），阿斯利康制药有限公司，国A2002002。新西兰大白兔给药剂量为临床用药剂量的5倍，每日剂量分2次灌胃，连续5 d，末次给药后1 h，腹主动脉取血，离心、分离备用。

1.1.2 主要仪器与试剂

CO2恒温培养箱（德国Heraeus公司）；FACS Calibur 流式细胞仪（BD.USA公司产品）；FLUOVIEW FV100共聚焦荧光显微镜（日本OLYMPUS公司）；DMEM、胰蛋白酶（Gibco BRL. USA产品）；Ⅱ型胶原酶 （Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）；α-SMA抗体（武汉博士德公司产品）；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（南京凯基生物公司产品）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠VSMC原代培养

雄性wistar大鼠，体质量200～250 g，购自湖北省动物实验中心。戊巴比妥钠腹腔麻醉后迅速分离、取出腹主动脉，小心剥除血管外膜，纵行剪开血管。PBS洗两次，剪成0.5～2 mm大小的组织块，放入含有1 mg/mLⅡ型胶原酶溶液的离心管中，37 ℃温箱中消化30 min。剧烈震荡离心管，除去内皮细胞，将取出的组织块放入1 mg/mL II型胶原酶溶液中，37 ℃温箱中消化4～6 h，待组织块呈絮状后终止消化。离心，去上清，重悬细胞，转入培养瓶中。待细胞长至75%汇合度时，消化传代，取2～5代细胞用于实验。

1.2.2 原代培养的大鼠VSMC免疫组织化学检测

细胞接种到6孔板中，培养72 h，去上清，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，加入0.3%TritonX-100，倒掉后再加入TritonX-100室温透化15 min，滴加30 μL血清封闭液（二抗宿主来源），室温封闭30 min。加入一抗α-SMA抗体（1∶50），4 ℃孵育过夜。加入FITC标记羊抗小鼠二抗（1∶100），37 ℃孵育30 min，同时加4’，6二脒基-2-苯吲哚盐酸（4’，6-diamino-2-phenylindole，DAPI）染细胞核，37 ℃孵育30 min，封片后荧光显微镜下观察。

1.2.3 细胞分组与药物干预

取生长状态良好的细胞胰酶消化，制备细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/mL。将处理好的盖玻片放入6孔板各孔中，每孔准确接种900 μL细胞悬液，继续培养后将细胞分为空白组、HCY组、葛根通脉饮组、瑞舒伐他汀（可定）组、葛根通脉饮联合可定组。除空白组外，各组均加入剂量为10-4mol/L同型半胱氨酸，培养24 h后，葛根通脉饮组加入葛根通脉饮含药血清，可定组加入可定含药血清，葛根通脉饮联合可定组同时加入葛根通脉饮、可定含药血清，培养48 h后，收集细胞。

1.2.4 Annexin V-PI法检测细胞凋亡率

各组细胞用PBS洗涤，0.125%胰蛋白酶消化，转移至离心管，加培养液，混匀，1000 r/min离心，弃上清，加PBS，重悬细胞，调整细胞浓度为106/mL，取0.5 mL细胞悬液，1000 r/min离心4 min，弃上清，加0.5 mL Binding Buffer，重悬细胞，加1 μL荧光标记的annexin V试剂，混匀，室温下避光孵育20 min，加入PI 5 μL，混匀后4 ℃下避光孵育5 min，加入Binding Buffer 500 μL，随即用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，用Flow max 2.4软件进行数据处理。

1.2.5 数据统计与分析

各组细胞测定值以均数±标准差（x¯±s）表示，使用SPSS10. 0软件包进行单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。

2 结 果

2.1 原代培养的大鼠VSMC形态及免疫组织化学检测结果

倒置相差显微镜观察，培养的细胞多数呈长梭形，核大，细胞核呈蓝色，细胞质呈现绿色，可见明显的肌丝纤维。免疫组化结果显示，细胞胞质内特异性标志蛋白α-SMA表达呈阳性者超过98%的，提示培养细胞为VSMC。

2.2 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测结果

与空白组（4.36±0.25）比较，HCY组（1.17±0.15）细胞凋亡率显著降低（P＜0.01），提示HCY可诱导VSMC增殖；葛根通脉饮、可定均可显著促进VSMC凋亡，葛根通脉饮组（3.08±0.14）、可定组（2.35 ±0.24）、葛根通脉饮联合可定组（3.23±0.22）大鼠VSMC凋亡百分率与HCY组相比较，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

3 讨 论

AS及其所致的冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑卒中是目前世界范围内两大主要死亡原因[2]。研究证实，AS的主要病理形态学特征之一是VSMC向动脉内膜的迁移和增殖。脂质代谢紊乱、高HCY血症等AS危险因素可损伤血管内皮细胞，引起血小板和单核巨噬细胞黏附、聚集，血小板释放的细胞因子促使VSMC迁移至血管内膜，在内膜增殖后，VSMC和巨噬细胞荷脂形成泡沫细胞，VSMC还可合成胶原纤维等基质，进而形成AS斑块，因此，抑制VSMC迁移和增殖，对于延缓或阻止AS病变发生发展及心血管病防治具有重大意义[3]。

我们的前期研究发现[4-6]，作为单体的葛根素具有保护血管内皮细胞，调节血脂水平，抑制VSMC增殖等良好的抗AS作用，葛根素预防性给药能明显抑制兔主动脉AS病变，其机制与调控细胞周期、影响内质网应激水平、抑制AS过程中炎性反应等密切相关。在前期工作的基础上，根据临证经验，我们以葛根为主药，将葛根通脉饮方剂应用于临床，治疗AS及其所致心脑血管疾病。方中葛根升阳解痉，通利血脉为君；赤芍、川芎行血活血，山楂活血散瘀、化痰行气，共助葛根散瘀通脉为臣；淫羊藿、太子参升提脾肾之阳气，当归补血养血，三药同用，达气帅血行，通而不滞之功，为佐药；炙甘草补中益气，固护脾胃，调和诸药为使。本实验中，葛根通脉饮组和葛根通脉饮联合可定组大鼠VSMC凋亡百分率显著高于HCY组，提示葛根通脉饮可显著促进VSMC凋亡，可能是其抗AS作用机制之一。

[1] Ghatak SB,Dhamecha PS,Bhadada SV,et al.Investigation of the potential effects of metformin on atherothrombotic risk factors in hyperlipidemic rats[J].Eur J Pharmacol,2011, 659(2/3):213-223.

[2] Hansson GK,Hermansson A.The immune system in atherosclerosis[J].Nat Immunol,2011,12(3):204-212.

[3] 李桂源.病理生理学[M].北京:人民卫生出版社,2011:341-350.

[4] 沈晓君,魏群,陈芳,等.葛根素诱导血管平滑肌凋亡的细胞周期调控机制研究[J].新中医,2011,43(2):139-141

[5] 魏群,陈芳,沈晓君,等.葛根素对兔动脉粥样硬化炎性因子的影响[J].中国老年学杂志,2011,31(18):3541-3543.

[6] 沈晓君,魏群,陈芳,等.葛根素对血管平滑肌细胞周期相关蛋白表达的影响[J].中国中医基础医学杂志,2011,17(1):69-70.

R285.5

B

1671-8194（2014）24-0069-02

河南省教育厅科学技术研究重点项目（13A310612）

*通讯作者：E-mail：shenxiaojun0628@163.com