豚鼠遗传检测方法研究进展

李芳芳，岳秉飞

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)

综述与专论

豚鼠遗传检测方法研究进展

李芳芳，岳秉飞

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)

豚鼠作为一种常用的实验动物，广泛应用于生物医学研究中的各个领域,其遗传质量的稳定性直接影响着它的发展和应用。遗传检测目的是为了证实各品系动物应具有的遗传特性，检查是否发生遗传污染和遗传突变等，确保被检对象符合该品系的要求。生化标记和分子标记技术的出现，为实验豚鼠基因纯合度、遗传类型检测、遗传质量监测提供了更为简便可靠的研究手段。本文就生化标记、细胞学标记和分子标记在豚鼠多样性研究中的应用及研究进展进行了论述，为豚鼠遗传检测方法的建立提供帮助。

豚鼠；遗传检测；分子遗传标记；

实验动物作为生命科学研究中重要的实验材料，其遗传背景对实验结果的影响至关重要，生物医学实验要想得到可靠的可重复的实验结果必须使用遗传特性稳定的实验动物。

豚鼠作为重要的实验动物，具有特殊的生物学特性和生理解剖特点。目前，在速发型过敏性呼吸道疾病的研究，实验性坏血病的研究，各种抗结核病药物的筛选，听觉和内耳疾病的研究等方面都是最佳选择[1]。国内使用的豚鼠多为短毛的英国种豚鼠，属于封闭群，遗传结构呈杂合性，遗传背景不明确，需要进行定期的遗传检测。本文就生化标记技术，细胞标记技术及分子标记技术在豚鼠多样性研究中的应用及研究进展进行综述。

1 豚鼠遗传检测方法的研究进展

遗传检测是通过形态学，免疫学，生物化学和分子生物学等方法来测定动物品系的遗传组成是否发生变化[2]，是遗传监测的重要内容之一。遗传标记是指在遗传分析上用作标记的基因，也称标记基因。自从19世纪中期，形态学标记被首次应用以后，遗传标记就得到了广泛的应用。以外部特征为主的形态标记，以染色体的带型和核型为主的细胞学标记，以生物体内生化性状为主的生物化学标记，以免疫学特征为主的免疫学标记和以核苷酸序列变异为主的分子标记都属于遗传标记。生化标记在豚鼠遗传检测中比较常用，分子标记在豚鼠遗传检测中处于发展阶段。本文主要讲述细胞学标记，生化标记和分子标记技术在豚鼠遗传检测中的应用及发展趋势。

1.1 细胞学标记

细胞学标记主要指染色体的带型和核型分析。染色体作为遗传物质的载体, 其变异必然会导致生物体发生遗传变异。染色体数目的变异( 整倍性或非整倍性) 和染色体结构的变异( 缺失、易位、倒位、重复等)是染色体的主要变异 , 染色体的形态(着丝点位置)、缢痕和随体等核型特征也是多样性的来源[3]。

经过特殊处理染色体会出现不同的带型，C带和G带是常见的染色体带型。胡根林等[4]观察了浙江中医药大学动物实验研究中心培育的Zmu-1:DHP豚鼠染色体的G带、C带及银染核仁组织者，结果表明核仁组织者的数目和位置均较恒定, G带与其他豚鼠有差异,C带则与其他哺乳动物相似, 说明Zmu-1:DHP豚鼠在染色体核型上已发生变异。

细胞学标记直观、稳定，为动物的遗传检测提供了较好的方法，但标记数目有限，多态性差等不足之处使其发展受限。

1.2 生化标记

生化标记是以生物的某些生化特征作为遗传标记，主要指异构蛋白标记和同工酶标记等。利用生化标记研究豚鼠生化基因位点多态性这种方法始于1971年，根据同工酶的多态性来鉴定和区别动物品系，达到遗传检测的目的。

1986年，Casikl[5]检测了7个豚鼠品系共20种同工酶和蛋白质的多态性，日本的浅野敏彦等检测了13个豚鼠品系的7种生化标记的多态性，两人共阐明了10种同工酶和蛋白质具有多态性现象，初步建立了豚鼠遗传概貌图[6]。国内，刘迪文等采用生化电泳法测定了Zmu-1：DHP育成品系豚鼠和该品系亲本DHP豚鼠的14个同工酶的遗传标记，结果发现了5个多态性位点。傅军[7]对Hartley品系豚鼠和Zmu-1：DHP品系豚鼠的血清蛋白进行了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，结果显示Zmu-1:DHP 豚鼠的血清蛋白可分辨出21 条蛋白条带，而Hartley 品系豚鼠有20 条蛋白条带，这表明两品系豚鼠血清蛋白组成上有差异。蔡月琴等[8]比较分析白毛黑眼(WHBE) 豚鼠、花色豚鼠和DHP 豚鼠三个品系豚鼠在13 个血液蛋白位点上的多态性，结果发现Tf1、Ptf、Tf2、Est1 和Es 在三个豚鼠品系中表现为多态，其中Tf1 可作为识别WHBE 豚鼠的遗传标记。

生化标记与细胞遗传学特征相比分析简单快速、数量上更丰富。不足之处是检测的位点局限，大多是单基因遗传的位点，不能反映动物的整个的遗传概貌，并且其结果不易判读。

1.3 分子标记

分子标记是近年来现代遗传标记学发展最快的领域之一，它以个体间遗传物质内核苷酸序列的变异为基础。限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA (random amplified polymorphic DNA，RAPD)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、微卫星DNA(microsatellite DNA)和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)等是在豚鼠遗传检测中可以使用的分子遗传标记，本文针对这些方法目前的研究现状及存在的问题探讨了今后的研究趋向和发展。

1.3.1 限制性片段长度多态性：RFLP始于20世纪80年代初，以DNA-DNA杂交为基础。RFLP技术是一种高效的基因组DNA多态性分析技术，不同基因组DNA经限制性内切酶酶切后，检测含同源序列的酶切片段长度的差异。作为发展最早的分子标记技术，它主要用于遗传图谱构建和基因定位等，在遗传分析中得到了广泛的应用。曹宏卿等[9]通过12种限制性内切酶酶切，运用mtDNA的RFLP标记分析了FMMU白化豚鼠和花色豚鼠的遗传多样性，结果表明FMMU白化豚鼠区别于花色豚鼠的生物学特性和mtDNA不相关。

RFLP技术多态性高，重复性和稳定性好，是群体遗传变异分析强有力的工具，但由于操作繁琐，信息含量低，需要样本量大等不足，使该方法的应用受到了很大的限制。

1.3.2 随机扩增多态性DNA：RAPD分子标记技术利用10 bp左右的随机引物对生物基因组DNA进行随机扩增，是以PCR扩增技术为核心发展起来的。RAPD-PCR可用于分析同一群体的不同个体之间和同一物种的不同群体之间的遗传相关性和变异性[10]。最初由Williams和Welsh实验室[11-12]发展而来，被广泛应用于个体和品系鉴定、基因定位、遗传多样性检测、遗传图谱的构建等研究中。

RAPD分子标记技术在豚鼠遗传多样性研究中应用相对较少，但也不乏一些研究值得借鉴。刘迪文，郭汉身[13]采用RAPD方法，用40条随机引物，对10只Zmu-1:DHP豚鼠和12只对照的DHP豚鼠DNA样品，进行扩增。结果其中有3条引物的扩增条带存在多态性，多态现象主要表现为DNA序列长度呈多态性引起的扩增带位置差异。

近年，国内外利用RAPD技术在一些动物、植物、微生物种群分析和遗传作图等方面取得了重要进展[14-17]。RAPD标记灵敏度高，多态性强，可用于不同生物基因组多态性的研究。90年代前期RAPD技术被广泛应用，但随着研究的深入，人们发现该技术也有不足的一面，比如它检测的变异来源不清，受实验条件的影响较大，不能区分杂合子和纯合子。

1.3.3 扩增片段长度多态性：AFLP标记技术是一种对未知区域多态性进行全基因组扫描的技术，是由Zabean[18]和Vos[19]两位科学家发展起来的。AFLP技术的原理如下：首先将DNA用内切酶酶解，接上接头，设计引物，然后进行特异性PCR扩增。扩增的产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可产生数量丰富的带型标记，分辨率高。

自Vos等1995 年创立至今, 已有大约5 500篇关于AFLP标记的外文文献, 在植物等领域中的应用已极为成熟。尽管近年来在医学领域应用AFLP标记的文献日益增多，但以病原微生物的分类与鉴定等方面为主[20-23],应用于疾病相关的分子标记筛选的文献相对较少。陶爱林等[24]在建立豚鼠听力衰退模型基础上，结合D-半乳糖致衰及噪音的刺激，应用AFLP分子标记技术，采用混合极端类型方法，对模型中的极端个体进行全基因组扫描，以获取包括核基因组水平上的分子标记，为AHL(老年听力衰退)分子机制研究提供新的切入点。结果表明14对选择性扩增引物仅扩增到一个能将两类极端表型绝然分别开来的多态性条带。

AFLP标记具有多态性检出率高、快速、可靠等优点。但该标记无法准确鉴定杂合子，费用昂贵等缺点使其发展受到了阻碍。

1.3.4 微卫星DNA：微卫星DNA是指一些简单的串联重复序列，因为其重复单位比小卫星的短, 故被称为微卫星( microsatellite)，是指以几个核苷酸( 一般为1～6 个) 多次重复组成的串联序列。由于其高度可变区核心序列重复数目的不同，产生了DNA多态性[25]，又被称为简单序列重复( simple sequence repeats，SSR)，长度多在100 bp以内。

大鼠、沙鼠、小鼠、家兔、和猪等实验动物的微卫星标记都有专门的报导并被应用于遗传图谱构建、遗传多样性评估、标记辅助选择和遗传监测等领域，推动了人类疾病动物模型的建立、实验动物品系的保持和新品系的培育、功能基因定位和克隆等研究工作的进步[26-31]。由于豚鼠在遗传背景上与大小鼠、家兔等物种差别较大[32-33]，故无法借鉴这些物种的微卫星位点进行扩增。

获取豚鼠微卫星位点序列的常用方法有磁珠富集法和基因组数据库筛选法。近年来磁珠富集法被广泛用于微卫星筛选研究中[34-36]，它具有阳性克隆率高、筛选效率高等优点[37]。1998年浙江中医药大学动物实验研究中心豚鼠繁殖中心引进了Dunkin Hartley 豚鼠封闭群，至今已形成1 000个个体的种群。中心研究人员通过磁珠富集法筛选获得了17对豚鼠微卫星位点[38]。朱亮等[1]检测我国现有的Dunkin Hartley豚鼠封闭群的遗传背景，利用8个多态性好的微卫星标记，初步确定了豚鼠群体的遗传概貌，为豚鼠封闭群遗传监测方法和标准的建立提供基础。刘迪文，杨伟伟等利用磁珠富集法和基因组数据库筛选法获取豚鼠微卫星序列，共获得26个多态性微卫星标记，45个潜在的候选标记，为微卫星标记在豚鼠遗传质量监测及突变基因定位等工作的应用奠定了基础。今后仍需选择更多的微卫星位点来分析更多的品系，加强微卫星位点选择和检测方法的标准化研究。

微卫星标记在基因组中分布广泛, 多态性高，按孟德尔遗传规律遗传[39]，操作简便,信息量大，是理想的分析变异的标记之一，但筛选和检测微卫星DNA的过程复杂，这给微卫星标记的应用带来困难。

1.3.5 单核苷酸多态性：SNP是指在基因组水平上由于单个核苷酸位置上存在颠换、置换、缺失和插入等变异所引起的序列多态性，并且任一种等位基因在群体中频率大于等于百分之一，是一种二等位基因标记[40]。

SNP是人类基因组中最常见的变异形式，是药物反应和疾病易感性的决定因素[41]。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，具有代表性、密度高、，遗传稳定性等特点，能够全面反映基因组遗传变异情况[42]。

近年来，SNP技术被用于近交系小鼠的遗传质量检测，并且建立了近交系小鼠的SNP数据库[43]。目前，SNP标记用于豚鼠遗传检测的报道甚少，Oostendorp J[44]等克隆了远交Dukin Hartley豚鼠的β2-肾上腺素受体基因，并在该基因的编码区中筛选出5个简并SNP，它们与人β2-肾上腺素受体编码区的多态性没有显示出任何相似性。作为第三代遗传标记, 随着技术的发展,SNP 的应用潜力将会不断的发掘和体现。

2 结语

遗传检测的最终目的都是要揭示实验动物的遗传背景，确保被检测对象符合相应的要求。作为常用实验动物，豚鼠的特征十分显著，但其分子标记的数量尚不能满足需要，遗传检测还处于探索阶段，所以国内豚鼠的遗传背景和检测标准有待进一步完善。

随着分子生物学的发展，分子遗传标记必将不断改进完善，更多更有效快捷的分子标记技术将会应用于豚鼠的遗传检测中。在DNA分子标记技术的日益成熟和不同检测方法的联合使用下，豚鼠的遗传背景将会有更深入的研究。

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Research progress of genetic monitoring methods in guinea pig

LI Fang-fang, YUE Bing-fei

(National Institute for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

Guinea pig as a commonly used laboratory animal is widely used in various fields of biomedical research. The stability of genetic quality directly affects its development and application. Genetic testing is designed to confirm the genetic characteristics of each strain, to verify whether there are genetic mutations and other genetic contamination, to ensure that the test object meets the requirements of this strain. Along with the emerge of biochemical and molecular marker technology, a more convenient and reliable means is provided for research of genetic homozygosity, genetic type detection and genetic quality monitoring of guinea pigs. In this paper, the application and research progress of biochemical, cytological and molecular markers in studies of guinea pig diversity will be summarized, and provide some help for genetic testing guinea pig.

Guinea pig; Genetic testing; Molecular genetic markers.

国家科技支撑计划(2013BAK11B01)。

李芳芳(1988-)，女，硕士生，主要研究方向：分子遗传学，Email: lifangfang0601@163.com。

岳秉飞(1960-)，男，研究员，主要研究方向：实验动物遗传学，Email: yue-bingfei@org.cn。

R33

A

1671-7856(2014) 08-0062-05

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.014

2014-05-06