靶向肿瘤干细胞的新治疗策略

李 明

中南大学湘雅医学院医学检验系临床生物化学教研室，长沙410013

肿瘤干细胞由 Bonnet等［1］于 1997年首次从CD34+CD38-急性髓性白血病 (acute myeloid leukemia，AML)细胞中分离，其细胞具有自我更新、多能分化和产生肿瘤细胞异质谱系的能力，是一组具有增殖和形成新肿瘤能力的细胞亚群，所以肿瘤干细胞被定义为一种具有自我更新能力的癌细胞，其能再生出具有各种分化异质性的原始肿瘤。通常认为肿瘤干细胞处于一种相对静息的状态和具有正常干细胞的许多特征。例如，表现出较低的增殖速率、DNA损伤修复活性、抗凋亡基因表达上调［2-3］，以及通过表达几种ATP结合盒 (ATPbinding cassette，ABC)转运体而耐受药物和毒素，因此可避免化疗药物的攻击，从而“保护”肿瘤的连续性和逃避传统治疗方法，从而获得增殖能力并维持肿瘤发生，形成肿瘤［4-5］。

近来多项临床研究证明，肿瘤干细胞在肿瘤发生、存在和转移中发挥作用，如肿瘤干细胞能在非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠中形成白血病异种移植物。AI-Hajj等［6］首次证实实体肿瘤中存在肿瘤干细胞，只需从乳腺癌中分离获得200个上皮细胞黏附分子 (epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)+CD44+/CD24-肿瘤干细胞就能在体内形成肿瘤。研究显示，肿瘤干细胞与肿瘤转移有关，并已证实存在肿瘤干细胞标志物，如乳腺肿瘤干细胞标志物，包括醛脱氢酶 (aldehyde dehydrogenase-1，ALDH-1)、EpCAM和 CD133［7］，CD133、CD44、ALDH-1、EpCAM、CD29及 CD166可在结肠癌发生中起作用［8］，CD44+、CD24+、EpCAM+细胞则与胰腺癌肿瘤干细胞相关。

靶向肿瘤干细胞的周围微环境

微环境龛肿瘤干细胞有2个微环境:(1)围血管龛，与神经干细胞中的龛相似［9］。由于内皮细胞NO合成酶 (endothelial nitric oxide synthase，eNOS)表达上调和血管内皮细胞分泌NO，肿瘤干细胞的围血管龛来源于肿瘤干细胞强效调节因子，如整合素αβ和NO，它们能调节Nestin和Notch相关的关键干性通路［10］。胶质瘤CD133阳性肿瘤干细胞能表达低氧诱导因子HIF-1a［11］，而抑制低氧诱导因子可导致体内肿瘤干细胞的自我更新、增殖和存活受抑。(2)肿瘤干细胞定位的肿瘤低氧区域。研究证明，这些低氧区域与治疗耐受、局部侵袭和不良临床结局相关，尤以神经母细胞瘤、宫颈癌和乳腺癌中常见的未分化实体瘤表型与肿瘤低氧显著相关［12］。因此，这类低氧龛已成为某些新治疗手段的主要靶点。通常认为，阻断肿瘤血管生成后，由于缺乏营养和氧气，肿瘤会萎缩死亡。但是抗血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)疗法可导致胶质母细胞瘤、小鼠模型乳腺癌和胰腺癌的转移增强［13］。研究证明，尽管抗血管生成药物在转移性结肠癌、晚期非小细胞肺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、转移性乳腺癌和胃肠道基质肿瘤中取得一些临床治愈，但尚未观察到总的生存治愈 (完全治愈)。其他促血管生成因子的上调、血管变化和遗传突变可能是其缺乏疗效的原因［14］。处于缺氧条件时，癌症微环境中的细胞，如成纤维细胞、炎性细胞外基质等可能通过分泌各种因子来促进肿瘤侵袭。通过激活Oct和Notch信号通路，低氧环境能增加肿瘤内CD133阳性肿瘤干细胞的数量。说明尽管肿瘤干细胞似乎需要低氧环境，但制造缺氧也可促转移，提示创新性血管正常化研究可能是解决该问题的一个方向。

血管网络作用血管网络在肿瘤形成中具有重要作用。共移植人髓母细胞瘤细胞和内皮细胞导致肿瘤的生长速度和体积都大于单一癌细胞移植，且共移植导致肿瘤干细胞数量增加达25倍，表明内皮细胞对肿瘤干细胞自我更新和未分化状态的维持也有作用。肿瘤干细胞也被认为能分泌促进肿瘤血管扩张和形成的血管生成因子，提示两者间存在双向联系。研究证明，表达于肿瘤细胞和内皮细胞表面的趋化因子受体CXCR4和肿瘤相关成纤维细胞分泌的基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)可相互作用，促进血管生成［15-16］。细胞迁移和侵袭呈SDF-1梯度依赖性，表明这种现象可能在肿瘤转移中起关键作用。研究证实，CXCR4阳性癌细胞能以SDF-1依赖性的方式转移到骨头和淋巴结。不仅如此，SDF-1与CXCR4相互作用可激活磷脂酰肌醇-3激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)，继而激活丝氨酸-苏氨酸激酶Akt，导致肿瘤细胞的存活和增殖加强。值得注意的是，CXCR4结合其配体后能被快速内化，使其成为靶向肿瘤干细胞微环境癌症治疗药物的理想靶点。使用CXCR4拮抗剂的联合疗法能提高白血病细胞对阿糖胞苷的敏感性［17］。

肿瘤干细胞靶向临床研究

围血管龛治疗策略肿瘤周围形成的新血管供应对肿瘤的发展和转移具有至关重要的作用，被称为肿瘤围血管龛。Calabrese等［18］建立了一个共同培养模型来研究血管内皮细胞对肿瘤干细胞的影响，结果发现内皮细胞可提供支持肿瘤干细胞自我更新的因子，与Nestin+/CD133+的脑肿瘤干细胞作用密切。然而，该项研究仅显示了靶向VEGF的抗血管治疗可减少肿瘤的血管系统，部分地破坏了肿瘤干细胞的血管龛。该结果显示出VEGF作为靶向肿瘤干细胞血管龛的治疗策略的特异靶点。

低氧龛治疗策略小白菊内酯 (parthenolide，PTL)是一种倍半萜内酯，可以抑制DNA合成，激活癌细胞增殖和核因子-κB，增加细胞内活性氧簇 (reactive oxygen species，ROS)。研究表明，PTL可在体内和体外有效杀伤白血病干细胞 (leukemia stem cell，LSC)，因此通过外部氧化应激操纵肿瘤干细胞低氧龛来杀伤肿瘤干细胞是一个新的靶向肿瘤干细胞的治疗途径。有研究者发现，生理条件下不同的氧气水平能影响肿瘤干细胞中低氧诱导因子2α(hypoxia inducible factor-2α，HIF2α)的水平。HIF2α能诱导肿瘤细胞增殖，帮助肿瘤细胞存活。但该因子只是在肿瘤干细胞中所必须，在正常神经始祖细胞中并不被表达，提示HIF2α是靶向肿瘤干细胞低氧龛治疗策略的特定靶点［19］。

靶向信号通路肿瘤是一种公认的高度异质性疾病，肿瘤干细胞标志物的表达也被认为是异质性的，这也是对肿瘤单一药物疗法无效的原因［20］。事实上，肿瘤早期阶段肿瘤干细胞的基因型、数量和表型很可能与晚期阶段存在高度差异，鉴于癌症发展过程中会出现突变多元化和克隆选择，这个说法也并非不可能［21］。有研究者推测，由于肿瘤干细胞和肿瘤干细胞龛之间存在双向信号转导，肿瘤进展过程中原始肿瘤干细胞群会出现进化［22］。此外，对人转移性结肠癌的父代和克隆肿瘤细胞进行详细核型分析的结果表明，肿瘤干细胞中存在遗传不稳定性［23］，提示不能使用单个标志物来靶向这些细胞，因为靶向单个分子的抗体只能改善肿瘤治疗的预后而不能达到治愈的目的。其可能的原因是靶蛋白的下调、产生耐药性或者肿瘤干细胞群中亚克隆的遗传多样性。所以目前认为，通过靶向2或3个独立的肿瘤干细胞信号通路有效杀死所有肿瘤细胞和减少耐药性克隆出现的概率非常关键。

临床试验性研究新近研究认为，非肿瘤干细胞可以转化为肿瘤干细胞影响和干扰肿瘤患者的临床预后，如果要改善这一点，则需要根除大部分非肿瘤干细胞和肿瘤干细胞。通常采用“双击策略”，即采用传统疗法靶向主体癌细胞，接着是肿瘤干细胞靶向疗法。减积疗法能显著降低非肿瘤干细胞的肿瘤负荷，并使全身给药药效到达肿瘤干细胞，为阻断调节肿瘤干细胞功能的内源性和外源性信号通路奠定基础。当今肿瘤干细胞的临床试验研究不断深入开展，将人肿瘤细胞或细胞系异种移植到免疫缺陷动物体内，通过共同注射肿瘤基质、内皮细胞或间质细胞和肿瘤细胞对异种移植模型进行改良［24］。已有研究证明，原位异种移植物是其原发肿瘤活检的代表［25］。同样地，用于研究化疗药物作用的动物模型也有多种［26］。尽管试验性研究对于解析肿瘤干细胞的分子和细胞生物学来说是必要的，但肿瘤干细胞靶向疗法的临床试验结果仍至关重要。目前肿瘤学和纳米医学的分子细胞生物学最新研究进展揭示了多个肿瘤干细胞潜在靶点，并提供许多新的治疗方法。

肿瘤干细胞特异性标志物

通常细胞表面标志物在正常干细胞和肿瘤干细胞上都广泛表达，尽管其在正常干细胞中表达较低。

CD133与肿瘤干细胞的相关性CD133与肿瘤干细胞广泛关联，已在乳腺、脑、结肠、肝脏、肺、骨肉瘤、卵巢、胰腺和前列腺中被证明，是至今被鉴定的多种类型肿瘤干细胞中固有的一种最重要标志物，也是最先被确定的实体肿瘤标志物之一［27］，且该标志物不局限于肿瘤干细胞，在分化的肿瘤细胞中也有表达。最近研究显示，差异糖基化可能使与肿瘤干细胞相关的AC133表位发生差异折叠，从而导致在肿瘤干细胞分化成非肿瘤干细胞过程中，肿瘤干细胞表面的CD133发生构象变化［28］。这种构象变化提供了潜在的靶向选择，并可能最大程度上减少了正常干细胞中其他标志物所引发的某些不良反应，提示CD133在关键分子信号通路和药物或辐射耐受中发挥作用［29］。

CD133和分子通路研究认为，CD133与Notch信号转导通路相关，后者在肠上皮细胞分化和淋巴细胞增殖中可发挥关键作用［30］。由于Notch信号通路相关基因以及Notch1在CD133阳性胶质瘤细胞中过表达，这些细胞通常对化疗药物替莫唑胺 (temozolomide，TMZ)产生耐药性，原因可能是其能激活Notch和Hedgehog(Hh)信号通路。而TMZ暴露进一步强化这些信号通路的激活。Ulasov等［30］同时采用TMZ和Notch与Hh拮抗剂处理胶质瘤细胞，结果导致CD133阳性细胞的毒性作用显著增强。也有研究认为CD133不是与Notch通路相关的唯一肿瘤干细胞表面标志物。如人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)启动子区域含有Notch结合序列，因此也被认为与Notch相关。有研究发现，放射性疗法能提高患者胶质瘤样本中CD133阳性细胞的比例。因为CD133阳性胶质瘤细胞能有效修复DNA损伤和细胞凋亡减少，从而导致高水平的耐受性。DNA损伤细胞周期检查点蛋白 (DNA damage checkpoint，CHK)的激活对这些肿瘤细胞的高存活率非常关键，如果这些CHK的激活受到有效抑制，肿瘤干细胞的抗辐射性将被逆转。因此，克服治疗耐受性的一条可能的成功策略是在某些癌症亚型中联合使用CHK1/2抑制剂和现有的细胞毒疗法。

其他分子通路Wnt信号通路对于许多成体组织的内环境稳态和自我更新及造血均是必需的，它也参与许多器官中的肿瘤形成［31-32］。研究证明，Wnt激活与小鼠上皮细胞肿瘤相关。Wnt信号通路分子可与EpCAM的细胞内结构域相互作用，促进细胞增殖［33］。因此，靶向这条通路将是一种有前景的治疗选择［34］。由于EpCAM的过表达，其已成为很多免疫疗法的一个靶点。然而临床研究表明，抗EpCAM抗体未能引发初始预期的治疗应答，新一代EpCAM免疫治疗药物卡妥索单抗则具有抗CD3抗体和抗EpCAM抗体的作用。

研究发现，Hh通路在实体肿瘤的许多肿瘤干细胞中和LSC中异常激活［35］。通常胰腺癌相关基质细胞中Hh信号转导的抑制可阻碍肿瘤生长，但在实际癌细胞中，Hh信号转导的抑制则没有作用，提示旁分泌而非自分泌或内源性Hh通路是胰腺和结肠腺癌中肿瘤生长所必需的，其结果还证明了肿瘤微环境对于肿瘤持续生长的重要性［36］。

综上，肿瘤干细胞是癌症组织内部一组能自我更新、存活、增殖和形成新肿瘤的细胞亚群。尽管处于相对静息状态，肿瘤干细胞具有DNA损伤修复活性、凋亡耐受性以及化疗和放疗耐受性。由于肿瘤复发主要是由非肿瘤干细胞死亡引起的，因此未来肿瘤治疗不应单把肿瘤减积作为理想的治疗终点。考虑到非肿瘤干细胞和肿瘤干细胞之间能互为转换，要达到显著改善肿瘤患者临床预后的目的，必须同时根除非肿瘤干细胞和肿瘤干细胞。肿瘤干细胞群并不孤立起作用，而是依赖于来自其微环境的各种信号，即肿瘤干细胞被认为有2个微环境龛:围血管龛和肿瘤低氧区域。而相关的关键信号通路有Hedgehog、Wnt和Notch通路，它们是抗肿瘤干细胞治疗策略的关键靶点。总之，对肿瘤干细胞病理基础的分子生物学机制的深入了解，将会促进彻底根治肿瘤的新治疗靶点和新策略的开发。

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