PMA-PCR技术在植物病原细菌检疫中的应用前景

刘 鹏 牛春敬 胡佳续 冯 洁 王金成 黄国明

（天津出入境检验检疫局 天津 300461）

1 前言

对于分子生物学检测技术来说，区分活菌和死菌是一个很大的挑战。因为在菌体死亡后数天至数周内DNA都能够保持相对完整[1]，所以基于聚合酶链式反应（PCR）的分子检测技术无法区分所扩增的核酸片段其模板DNA来自于活菌或者死菌。

叠氮溴化丙锭（PMA）是对DNA具有高度亲和力的光敏染料，其不能透过完整的细胞膜，但可以穿过受损的细胞膜进入细胞内，与暴露出来的DNA产生共价交联反应。在可见光（最大吸收峰为460 nm）的作用下，PMA所带的光敏性叠氮基团转化为高活性的自由基，并与结合位点附近的任意碳氢化合物反应形成稳定的共价氮碳键，致使DNA分子永久修饰，最后阻断DNA分子的PCR扩增反应[2]。光敏染料结合PCR检测技术能够分析和定量检测环境中的微生物，在临床诊断、食品安全检测及环境微生态学研究中得到了广泛的应用[3-5]。

在植物检疫工作中，病原物的活性问题是重要的工作依据，目前在没有获得纯培养菌株的情况下，分子检测方法在植物病原细菌检疫工作中仅作为初筛的手段，并不能作为鉴定的依据。目前也有学者通过ATP生物发光法、全菌培养检测、特殊基因片段检测等方法来达到鉴定活菌的目的。例如，陆宇等[6]通过实验证明mRNA作为结核分支杆菌活菌检测标志的可行性；Schaad N W 等利用Bio-PCR方法[7]达到检测活菌的目的。比较而言，PMA-PCR 方法作为近几年出现的新技术，具有简便、高效、准确的优点，能够一步完成植物病原细菌的分类鉴定和死活判定，在植物检疫领域有广阔的应用前景。

2 PMA-PCR方法的基本原理

PCR方法是一种DNA体外扩增的方法，当模板DNA被化学修饰后会阻断核酸合成反应，导致PCR反应的中断。死亡的细菌其细胞膜会出现损伤，而活的细菌具有完整的细胞膜结构，可以将染料分子排除在外，PMA-PCR方法利用了细胞膜完整性方面的因素达到区分活菌死菌的目的。

PMA和叠氮溴化乙锭（EMA）是两种能够对DNA分子具有高度亲和力的光敏染料，染料分子与DNA结合后在强光的作用下对DNA分子产生永久修饰，阻断PCR反应的进行。同时，反应体系中残留的未结合的染料分子在光照后与水分子反应分解成羟胺而失去交联活性,而活细胞中的DNA由于细胞膜的屏障作用不会受到染料的影响，在细胞裂解后也不会与失活的染料分子反应。通过这种方法，最终使死亡细胞中的DNA在核酸纯化中被选择性地剔除。2003年Nogva和Rudi等提出了EMA-PCR方法用于区分死菌和活菌，这项技术中应用了实时荧光定量PCR方法，相比较常规PCR而言，显著提高了检测的速度和灵敏度[8,9]。但由于EMA具有细胞毒性，其应用受到了很大的限制，而且2006年Nocker A.等[10]发现，EMA处理会造成活菌的基因组DNA损失，因此提出了与EMA结构类似的PMA结合荧光定量PCR的活菌检测技术。

3 PMA-PCR方法在检测中的应用

作为近年来应用的新技术，PMA-PCR技术在食品微生物和卫生环境监控方面应用较多，罗剑飞等[11]以大肠杆菌作为目标菌株，研究了应用PMA处理不同胁迫条件下制备的死细胞悬浮液的PCR扩增效果，认为利用热处理和异丙醇处理的细胞其细胞膜会有损伤，经PMA处理后能够阻断PCR扩增反应，而经紫外线照射致死的细胞其细胞膜完整，不会受到PMA处理的影响。研究结果还表明，当样品中PMA质量浓度大于3μg/mL、曝光时间大于3min时，PMA可以抑制细胞膜破裂的死细胞DNA的PCR扩增；PMA质量浓度高于50μg/mL时对活细胞DNA的PCR扩增有一定影响；当浊度小于10NTU时，PMA能有效抑制死细胞DNA的PCR扩增，而当浊度大于100NTU时，PMA处理失去效果。Cawthorn D M 等[12]建立PMA-PCR方法用来检测乳品和加工设备中可能存在的具有活性的阪琦肠杆菌（Enterobacter sakazakii）,由于该病原菌对孕妇和新生儿具有危险性，因此PMA-PCR方法能够评估食品中存在的风险。

在实际检测中，通常在荧光定量PCR中引入PMA染料，达到检测复杂样本中目标活菌的数量，即PMA-qPCR技术。与常规PCR相比，荧光定量PCR具有特异性强、灵敏度高、检测周期短、定量检测等特点，广泛应用于细菌/病毒等疾病检测[13]、基因表达[14]以及基因拷贝数分析[15]、口岸检疫[16]、临床诊断和血液筛查[17]、疾病的早期诊断、病原微生物定量分析、遗传病肿瘤诊断[18]基础理论研究方面等。王力均等[19]应用PMA-qPCR技术建立了快速检测发酵乳制品中副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）活菌的方法，实验表明PMA能够抑制107CFU/mL死菌DNA的扩增，该方法能够准确检测到样品中存在的活菌数量。仝铁铮等[20]以大肠杆菌作为模式菌，应用PMA-qPCR技术研究了氯和一氯胺消毒对病原菌的灭活特性，结果表明，PMA能够去除99.94 %和99.99%的来自非活性大肠杆菌和沙门氏菌的DNA，PMA-qPCR技术通过对活性菌的数量检测，得到氯和一氯胺对大肠杆菌的灭活曲线，能够准确评估消毒剂对病原菌的灭活效果。田聪等[21]在研究金黄色葡萄球菌活的非可培养状态（VBNC）的复苏中应用了PMA-qPCR技术，能够有效检出非可培养状态的菌体，克服了传统方法在工作中的漏检。Josefsen M H等[22]应用PMA-qPCR技术研究并建立了快速检测鸡肉中弯曲杆菌（Campylobacter spp.）量化数据的方法，由于VBNC状态菌体具有感染潜力，该方法不能扩增死亡的弯曲杆菌DNA，从而能够提供可靠的数据进行风险评估。Mateja K等[23]研究了冻干益生菌活性的量化检测方法，采用了PMA-qPCR检测技术，准确地对具有活性的益生菌数量进行测算。其他方法与之比较，传统的平板计数法操作繁琐，检测周期长且工作量大，难以满足现代食品生产和流通领域对检测的要求；应用流式细胞仪检测活菌能够比较准确地分析出活/死细菌的数量或两者的比例关系，但是流式细胞仪计数无法鉴定和识别某一具体的微生物，分析样品所需的荧光染料较多，价格昂贵，不适于大批量检测目标菌。

4 在植物病原细菌检疫工作中的应用前景

除了在医学、食品和环境微生物检测方面，PMA-PCR技术目前在植物病原细菌检疫方面也有应用研究[24]。冯建军等[25,26]研究并建立了检测玉米细菌性枯萎病菌的PMA-qPCR方法，研究表明，当菌悬液浓度不高于104CFU/mL，应用终浓度为1μg/mL或更高的PMA染料渗透处理后，可以完全抑制死菌DNA扩增，而活菌DNA的实时荧光PCR检测不受影响，该方法能有效区分玉米细菌性枯萎病菌死活细胞，有助于监测玉米种子中该病菌的活性。

在植物病原细菌检疫工作中，获得纯培养菌十分困难，尤其是种传细菌的检疫，很多分子检测鉴定结果仅作为初筛检测的手段，在未得到纯化菌株的情况下无法作为检出依据。PMA-PCR技术是近几年出现并得到应用的新技术，其可靠性经过大量数据验证[27]，但该技术在植物检疫领域的应用目前还处于起步阶段，需要大量工作来进行方法的建立。

在目前的行业标准中，基于PCR的分子检测方法应用比较广泛。作为样品初筛和纯化菌株鉴定的手段，分子检测方法无法判定病原菌死活问题成为其应用受限的根本原因。在未获得纯培养菌株的情况下分子检测结果是否能作为检出依据，也就是说能否单一应用分子手段完成植物病原细菌的检疫工作，PMA染料的应用提供了一个新的解决方案。在分子检疫鉴定方法中结合PMA染料，相当于在分子特异性检测中同时加入病原菌死活判定的信号。各种分子检测方法，尤其是应用前景广阔的DNA条形码技术[28]，引入PMA染料建立的PMA-PCR检测方法令人有很大的想象空间。总之，PMA-PCR技术对于解决目前细菌检疫存在的问题具有前瞻性的意义，为今后单一应用分子检测方法作为检疫手段提供了技术依据。

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