新布尼亚病毒流行病学及检测方法的研究进展

张丽萍 王玉春,2 赵 勇,3 马雪征 甄 维 胡孔新

（1.中国检验检疫科学研究院 北京 100123；2.河南师范大学；3.吉林大学）

1 前言

2010年，中国疾病预防控制中心在对湖北、山东、江苏、安徽、辽宁等部分地区发生的以发热伴血小板减少为主要临床症状的散发感染性疾病病例研究中发现一种新型布尼亚病毒，命名为发热伴血小板减少综合征病毒（Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Bunyavirus，SFTSV）[1]即为新布尼亚病毒，该病毒引起的疾病称为发热伴血小板减少综合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS）。对于这种人类新发现的新型病毒，对其形貌、结构、治病机制和传播原理等还处于初步研究阶段，大部分尚未获得确切的研究定论。研究表明，该病毒的传播不仅与蜱叮咬有关，而且SFTSV 可以通过血液接触造成人-人之间的传播[2,3]。因此，该病毒的早期诊断对疾病的预防和控制具有非常重要的意义。

针对SFTSV的研究综述，李德新等已经从病原学、流行病学特征、临床表现、实验室诊断和治疗等方面进行了初步介绍[4,5]。本文重点就SFTSV近期的基本特性、国内外流行病学动态及检测方法等方面的研究进展进行综述。

2 基本特性

2.1 病毒基因组

新布尼亚病毒属于布尼亚病毒科白蛉病毒属，有一种有包膜分节段的负链RNA病毒。病毒基因组包括L、M、S 3个片段，具有布尼亚病毒的一般特征，其基因组两端末端序列是反向互补的，所以通常由氢键作用形成"锅柄状"的双链结构，呈现出形态为环状RNA[6]。但是SFTSV的全基因组序列无论核苷酸和氨基酸与布尼亚病毒科其他病毒相比具有高度差异，与白蛉病毒属其他病毒相比，S片段相对保守，但其氨基酸同源性最高仅41%左右，L和M片段氨基酸同源性在21%-36%之间[4]。

2.2 病毒形貌

SFTSV病毒颗粒电子显微镜和原子力显微镜下呈球形，直径约为80-100nm，有双层脂质包膜，包膜表面有糖蛋白组成的突起。原子力显微镜下可见SFTSV球形颗粒，边界清晰，形状规则，阶高约30nm，表面平均粗糙度和表面均方粗糙度值分别约为0.420和0.342［7］。

2.3 临床症状

SFTSV感染潜伏期为7-14 d，起病急。胡建利等［8］对临床症状进行基本的统计，有发热（100%）、乏力（80%）、畏寒（60%）、全身酸痛（45%）、头痛（40%）等全身中毒症状；呕吐（60%）、恶心（45%）、腹泻（50%）、腹胀（20%）、呕血（10%）等消化道症状；牙龈出血（25%）、皮肤淤点淤斑（15%）、眼结膜充血（10%）等出血症状；浅表淋巴结肿大（45%）症状；血小板计数减少（100%），范围在（0.2-78×109）/L；白细胞计数减少（90%），范围在（1.1-11.2×109）/L。大多数患者很快出现肝、肾等器官功能受损，少数因病情进展快出现意识障碍、皮肤瘀斑、呼吸道、消化道出血等，可因休克、呼吸衰竭、弥漫性血管内凝血( DIC)等多脏器功能衰竭死亡［1,9,10］。

2.4 致病机制

目前关于S F T S V的致病机制已有初步的研究，SFTSV的感染可能激活了神经生长因子受体（TrkA）、血小板衍生生长因子受体（PDGFR）、血管内皮生长因子受体（VEGFR）等受体酪氨酸激酶（RTKs），并通过宿主细胞的RTKs-PI3K/Akt-mTOR 信号传导通路完成基因组复制、转录、病毒蛋白质合成、装配及子代病毒的释放等感染后期过程［11］。对于SFTSV致病机制的研究尚处于初级阶段，有待于研究者进一步研究获得全面详细的致病机制信息。

3 流行病学特征

3.1 国内流行病学特性

SFTS病例多散发于丘陵地貌的农村地区，野外作业人群容易被病毒感染，病例时间分布具有明显的季节性，一般始于3月，高峰期在5-7月，可以延续至11月份。病毒感染人群年龄分布在39岁至83岁之间，没有性别差异。目前认为其传播与蜱叮咬有关，人类可通过蜱虫叮咬而得病。接触患者血液、分泌物或排泄物可以导致病毒感染［12］。

对于国内SFTSV的流行病学特性研究，国内多个实验室对所在地区SFTSV进行了详细的研究，为SFTSV的流行病学研究提供确切的理论依据。

传播媒介方面，胡建利等［8］对2010年江苏省确诊的20例人感染SFTSV的病例进行临床特点和流行病学特征的描述分析，发病前2周内均有蜱虫叮咬史。刘芸等［13］调查2009—2011年辽宁省8市发热伴血小板减少综合征新病原， 2011年大连一起“蜱咬”发热伴血小板减少病例的血液样本中分离出SFTSV 毒株，与叮咬的蜱分离出的SFTSV毒株M片段全序列同源性高达99. 7%［14］，但未检出可能的自然界中的动物宿主鼠类携带SFTSV核酸。目前为止蜱虫还是已知的SFTSV的重要传播媒介。然而一些临床病例并没有明显的蜱叮咬史，因此SFTSV的具体传播途径尚不完全清楚［15］。

宿主方面，张文帅等［16］对2010年7-11月在江苏省南京6个地区的来源于人和动物的2853例样本进行研究，检测出5种动物( 犬、羊、牛、猪、鸡)血清样本SFTSV总抗体阳性，阳性率分别为6.40%、57. 14%、31. 82%、5. 33%和0. 98%; 人血清中SFTSV 总抗体阳性率为0. 94%。说明SFTSV属于人兽共患病，且存在地区差异。人群与动物SFTSV血清总抗体阳性率存在正相关关系。但尚不能获得动物传染给人的有力证据，还需要进一步研究。

区域差异性方面，浙江省首次发现SFTSV感染病例后，对患者血清进行了病毒分离，并且通过同源进化树分析得知所有毒株可以分为两个群，浙江省和湖北省分离株同源性最高达92.2%，江苏、河南、安徽、山东、辽宁分离株的同源性较高，可达89.0%，但是两群基因序列差异较大，可达53.1%，可见不同群的SFTSV 分布有地域性差异［17］。

回顾性分析发现，早在1996年江苏省就有类似发热伴血小板较少病例的报道［18］。说明可能不仅江苏省，我国其他地区在2009年以前均有可能存在SFTSV的局部流行只是2009年该病毒被发现命名以来才被重视。

3.2 国外相关报道

SFTSV虽然是我国首次发现的病毒，但并非仅在中国存在。2013年1月，在日本国内首次确诊SFTS。至2014年4月份，九州、四国、近畿等13个县有53人感染，其中21人死亡。调查发现，日本北海道、岩手和宫城等23道府县中检测的蜱虫均有携带作为传染源的病毒。此外，福冈、富山等3个县中也在蜱虫所栖息的山野的鹿等野生动物身上发现了感染病毒后产生的抗体，共计30个道府县确认有患者及病毒［19］。此外韩国感染SFTS病毒的患者共有36人，其中17人死亡［20］。美国密苏里州也发现与SFTSV高度相似的病毒引发的病例报告［21］。国外这些SFTS病原与我国现有的SFTS病原是否同源需进一步考证研究。

4 检测技术

4.1 病毒分离

病毒分离是病毒检测的金标准，是不可取代的经典方法。可以直观的观测到细胞病毒，借助仪器更可以观察到病毒颗粒。病毒的变异非常迅速，病毒分离法可以分离出最新流行的病毒变异株，对识别新发传染病意义重大。

病毒分离可使用早期SFTSV感染患者急性期的血清标本，可采用Vero、Vero E6等细胞或其他敏感细胞进行盲传，三代后即10-15d的实验周期，然后使用 Real-time PCR 病毒核酸诊断方法、ELISA、免疫荧光等方法确定是否分离到该病毒［4］。杜燕华等在SFTS患者急性期血清标本中，选核酸检测阳性、距发病时间 1 周内、保存质量好的164份标本，用非洲绿猴肾(Vero)细胞培养。经Vero细胞培养，仅少量样品培养物观察到轻微的细胞变化，但标本经3代培养后，进行实时荧光RT-PCR检测，阳性率40.85%。其中58份Vero细胞中电镜下观察到椭圆形或球形病毒颗粒［22］。

病毒分离技术在SFTSV检测中虽然经典，但是往往存在成本较高，培养时间较长，生物安全要求高，操作技术复杂，不易观察细胞病变等缺点。

4.2 病毒形态学鉴定

电子显微镜和原子力显微镜方法检测SFTSV，能够直观的观察到SFTSV病毒颗粒形貌［7］，但对样本完整性、病毒量及病毒液纯度要求较高，其不足在于检测结果取决于显微镜操作者的技能和专业知识，且显微镜方法的设备昂贵，不利于推广。

4.3 血清学检测技术

4.3.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）

将SFTSV NP编码基因应用转载表达的方法制备NP蛋白，用于包被和标记 HRP，建立双抗原夹心ELISA法，检测SFTSV特异性总抗体，灵敏度100%，特异性99.57%［23］。用捕获ELISA法检测患者急性期IgM，用抗原夹ELISA法检测患者恢复期IgG，发现5例2代病人滴度均在1∶640-1∶5120之间［24］。

4.3.2 免疫荧光染色技术（IFA）

用免疫荧光反应特异、稳定性较好的病毒株，接种于Vero 细胞培养，制成抗原片，以异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗人IgG抗体为二抗，建立IFA法，与RT-PCR比较，相对于RT-PCR法，IFA法灵敏度95.60%、特异性74.29% 、符合率89.68%［25］。

4.3.3 免疫胶体金技术

免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。刘娟等［26］应用血清学检测方法和实时荧光RT-PCR方法检测连续采集的烟台地区莱州、蓬莱疑似发热伴血小板减少综合征患者血清，用胶体金实验方法检测抗SFTSV IgM抗体，胶体金方法和ELISA方法检测结果总符合率为96.67%。

血清学检测方法的优点在于对病人血清做初步检测，应用免疫学原理检测病人血清中相应病毒的抗体，进行初步诊断，而且结果可以直接观察，但该方法的特异性不强。

4.4 核酸检测方法

核酸检测是SFTS早期检测和临床诊断的重要手段，其突出特点就是检测特异性强。SFTSV的核酸检测技术，现阶段主要是针对病毒S、M、L 基因片段的普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR方法。

吕慧荣等应用试剂公司和河南省疾病预防控制中心联合研发的SFTSV实时荧光RT-PCR检测试剂盒和同类普通RT-PCR检测试剂盒进行评价试验。检测对象为58例发热伴血小板减少综合征病例和100例发热待查门诊病例。相对于普通RTPCR方法，实时荧光RT-PCR检测方法的灵敏度为97.36%，特异度为100%，实时荧光RT-PCR方法，具有更好的灵敏度和特异性［27］。

虞吉寅等［28］以SFTSV的L基因组为靶基因设计引物探针，建立实时荧光RT-PCR检测方法并利用该方法对舟山市岱山县临床疑似患者血液、野鼠内脏、分离病毒等标本进行了SFTSV核酸快速检测。宋玉亮等［29］以SFTSV基因组M节段的保守区为靶区域，设计特异性引物和Taqman 探针，建立荧光定量RT-PCR。灵敏度为2×102- 2×103copy/mL。迟媛媛等［30］针对L、M、S基因设计引物探针，应用巢式PCR方法分别扩增22例SFTS确诊病例和20例正常人血清中SFTSV RNA的L、M和S片段，对不同引物扩增的灵敏度与特异度并进行比较，研究病毒检出率与血清采集时间的关系。获得结果S片段灵敏度最高，其次是L片段，未扩出M片段。血清中病毒RNA检出率比较，7 d 与7-14 d检出率差异无统计学意义。

任宜等［31］为进一步提高荧光定量RT-PCR在SFTSV检测中的准确性。通过套式RT-PCR扩增Ct值处于35 -40之间的血清样本，采用病毒分离、序列测定、blast 比对、同源性比较与聚类分析来鉴定样本中的新型布尼亚病毒。结果4份Ct值处于35-40之间的血清样本均检测到与阳性对照一致的扩增条带。现场检测中经常遇到Ct值处于35-40之间的临床病人血样无法及时报告，给临床和流行病学造成误诊或漏诊，任宜等通过对4份Ct值处于35-40之间的血清样本检测鉴定，为正确处理Ct值处于35-40之间的临床血清样本，提出一种新的检测思路，有利于SFTSV检测在结果的准确性和全面性方面的发展。

此外还有反转录环介导的等温扩增技术（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP）快速检测SFTSV，该技术有较高的特异性和敏感性,检出限为10TCID/50mL，结合荧光检测试剂(罗斯福)方法，结果在30min内通过观察颜色变化确定结果［32］。通过将反转录交叉启动扩增（reverse transcription cross priming amplification, RT-CPA）和垂直流（vertical flow, VF）偶联，快速准确的检测SFTSV。RT-CPA-VF检测限为100copies/反应,检测的敏感性和特异性分别为94.1%和100.0%［33］。利用SFTSV的非编码核苷酸建立 “质粒介导的RNA聚合酶I迷你复制子系统”［34］等。

随着准确、快速、简单和低成本的检测方法的不断问世，将有利于SFTSV在我国的进一步检测和预防。

5 防治与展望

研究团队已经发现苏拉明对白蛉病毒属 RNA的竞争性结合的阻碍作用，能有效抑制SFTSV病毒复制，为作用于SFTSV-N及其同源蛋白潜在治疗白蛉病毒属病毒疾病的治疗药物研发打下坚实的基础[35]。

SFTSV 感染起病急、病情重、病死率高，可以通过接触病人血液等传播，所以早期快速实验室确诊对于早期诊断、早期隔离、早期治疗、早期防控具有重要意义。对SFTSV的研究建立在生物学基础上，笔者已经初步了解SFTSV的基因组结构和表达策略。SFTSV基因组包括3片段，编码4中结构蛋白，包括两种外源糖蛋白（Gn、Gc），一种外壳蛋白（N）和一种超大的多聚酶（L），但对这几种蛋白的功能还缺乏更深入的了解。我国不同地区分离的SFTSV毒株序列存在巨大差异，与国外毒株之间的差异尚须做进一步研究。SFTSV致病机制仅做了初步的研究，对于病毒入侵、复制、引起机体损伤中的许多问题尚不清楚。血清学检测技术ELISA 、IFA 、GICA和核酸检测技术PCR、实时荧光RT-PCR方法以及新的RT-LAMP、RT-CPA-VF等检测方法，在SFTSV检测中已有初步应用，但需要更为准确、快速、简单和低成本检测方法，为SFTSV的防控打下坚实的基础。

SFTSV的研究仅仅是一个开端, 对它许多问题还有待进一步的探索和认知,，而对它的防治更是一个亟待解决的问题。

［1］Yu X J, Liang M F, zhang S Y, et al. Fever with thrombocytocytopenia associatied with a novel bunyavirus in china[J]. N Engl J Med, 2011,364: 1523-1532.

［2］Gai Z T, Liang M F, Zhang Y, et al. Person-to-person-transmission of severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus through blood contact[J]. Clin Infect Dis, 2012, 54(15): 249-252.

［3］Bao C J, Qi X, Wang H. A novel bunyavirus in China［J］. N Engl J Med，2011，365(9):862-863.

［4］李德新. 发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒概述[J]. 中华实验和临床病毒学杂志，2011，25（2）：81-84.

［5］吕沐天，孙颖，刘沛，等. 发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒研究进展[J].微生物学杂志，2013，33（2）：86-88.

［6］于霞丽，姜晓林，王涛，等.发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒微复制子的建立［J］. 病毒学报，2012，28（3）：246-251.

［7］张丽萍，王玉春，赵勇，等. 原子力显微镜观察SFTSVHB29株结果的初步分析［J］.检验检疫学刊，2014，24（2）：58-61.

［8］胡建利，鲍昌俊，祁贤，等. 20例人感染新布尼亚病毒的临床和流行病学特征分析[J]. 中国人兽共患病学报，2012，28（3）：302-305.

［9］刘庆辉，刘建贞. 新型布尼亚病毒感染17例临床观察［J］.中华内科杂志，2011，50（9）： 785-786.

［10］唐晓燕，崔宁，康锴，等.一起聚集性新布尼亚病毒感染病例的诊断与治疗分析［J］. 中华预防医学杂志，2012，46 ( 2):110-113.

［11］刘辰萱. 抑制新型布尼亚病毒感染化合物的筛选及其作用机制的研究［D］. 吉林：吉林大学：2013.

［12］Gai Z T, Liang M F, et al. Person-to-person transmission of severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus through blood cntact［J］.CID, 2012, 54: 249-252.

［13］刘芸，张洁，王博，等. 辽宁省新布尼亚病毒流行特点及生物特性分析［J］.中国公共卫生，2013, 29（5）：721-723

［14］刘芸，张洁，王博，等.大连市“蜱咬”患者新布尼亚病毒( SFTSV)的检测分析［J］.人兽共患病学报，2013，29（2）：7-10.

［15］姜晓林. “发热伴血小板减少综合征”病毒传播媒介及宿主调查研究[D].山东大学: 2012.

［16］张文帅，曾晓燕，周明浩等. 江苏省发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒血清流行病学调查[J]. 疾病监测，2011，26（9）：676-678.

［17］张磊， 张严峻， 丁钢强， 等. 浙江省首次发现新型布尼亚病毒感染病例及分离病毒分子鉴定［J］. 中华微生物学和免疫学杂志， 2011， 31 （12）： 1107-1111.

［18］林玉娣，姚祖述，缪小兰，等.一起不明原因暴发疫情的调查报告[J].疾病监测，1998，13（1）：29－30.

［19］http://frontlineplus.jp/blog/2014/04/24/706.php

［20］http://www.koreatimes.co.kr/www/news/nation/2014/05/116_157016.html

［21］McMullan LK, Folk SM,Kelly AJ,et al. A new phlebovirus associated with severe febrile illness in Missouri[J]. N Engl J Med,2012,367:834-841.

［22］杜燕华，黄学勇，邓文斌，等.新布尼亚病毒在非洲绿猴肾细胞中的培养与分离鉴定[J].中华预防医学杂志，2012，46（2）：169-172.

［23］Jiao Y J，Zeng X Y, Guo X L, et al. Preparation and Evaluation of Recombinant Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus Nucleocapsid Protein for Detection of Total Antibodies in Human and Animal Sera by Double-Antigen Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay［J］.J Clin Micro，2012，50(2):372 -377.

［24］Gai Z T，Liang M F，Zhang Y，et al.Person-to-Person Transmisson of Severe Fever With Thrombocytopenia Syndrome Bunyavirus Through Blood Contact［J］.Clin infec dis，2012，54(2):249 -252.

［25］黄学勇，杜燕华，李幸乐，等. 新布尼亚病毒 IgG 抗体间接免疫荧光检测方法的建立［J］.中华预防医学杂志，2012，46（2）：165-168.

［26］刘娟，宮连凤，韩文清，等.血清学方法和实时荧光PCR方法在新型布尼亚病毒检测中的应用研究［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2013，27（6）：489-491.

［27］吕惠荣，杨云慧，杜燕华，等.新布尼亚病毒核酸检测实时荧光RT-PCR方法的评价[J].中国卫生检验杂志，2013，23（5）：1186-1188.

［28］虞吉寅，王忠发，任宜，等. TaqMan 探针实时荧光定量反转录-聚合酶链反应检测新布尼亚病毒L 基因方法的建立与应用[J].疾病检测，2013,28（2）：132-135

［29］宋玉亮，叶继斌，熊晨晖，等. 一种新布尼亚病毒快速检测方法的建立及应用［J］. 中华检验医学杂志，2012，35(2):180-182.

［30］迟媛媛，翟慎勇，温红玲，等.发热伴血小板减少综合征患者血清中新型布尼亚病毒RNA 的检测[J].山东大学学报，2012,50（11）：118-121.

［31］任宜，王忠发，毛彬，等. 可疑为新型布尼亚病毒的进一步检测与鉴定［J］.中国卫生检验杂志，2013，23（4）：812-815.

［32］Yang G, Li B, Liu L, et al. Development and evaluation of a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of a new SFTS bunyavirus[J]. Archives of virology, 2012,157(9): 1779-1783.

［33］于霞丽，姜晓林，王涛，等. 发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒微复制子的建立[J]. 病毒学报. 2012; 28(3): 246-51.

［34］Cui L, Ge Y, Qi X, et al. Detection of severe fever with thrombocytopenia syndrome virus by reverse transcription-crosspriming amplification coupled with vertical flow visualization[J].Journal of clinical microbiology, 2012, 50(12): 3881-3885.

［35］Lianying Jiao，Songying Ouyang, Mifang Liang, et al. Structure of Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus Nucleocapsid protein in Complex with Suramin Reveals Therapeutic Potentials[J]. J Virol Aprilm, 2014, 88:73766-73775.