肝豆状核变性的基因诊断☆

刘磊磊 汤其强 韩若东 肖晗

肝豆状核变性的基因诊断☆

刘磊磊*汤其强*韩若东△肖晗*

肝豆状核变性基因诊断WD基因

肝豆状核变性又称威尔逊病（Wilson's disease，WD），系常染色体隐性遗传性铜代谢障碍疾病。世界范围发病率为1/10万-1/3万[1]，杂合子频率为1/100～ 1/200[2]，其中中国是高发区。该病是由于ATP7B基因突变，导致铜转运P型ATP酶缺失，从而导致血浆铜蓝蛋白降低及铜在体内器官的沉积等一系列临床表现。WD是目前少数可以治疗的神经遗传病之一，患者如果能在发病早期或症状前期即被确诊并得到及时治疗，大多预后良好，反之病情逐渐加重甚至危及生命[3]。目前临床上多是根据患者临床表现结合铜生化检测加以诊断，但并非所有患者都有生化方面的变化，大约40%的症状前期患者每天尿排铜量小于100µg，并且尿铜含量增高出现相对较晚，因此基因诊断至关重要[4]。基因诊断是WD病的最为明确、有效的诊断方法，对患者的家系成员，尤其是同胞应早期进行ATP7B基因突变筛查，有望检出症状前患者或轻症患者。本文就WD病的基因诊断技术做一综述。

1 传统的检测标准

目前对WD病多采用以下标准[5]：①家族遗传史：父母是近亲婚配，同胞有WD患者或死于原因不明的肝病；②缓慢进行性震颤、肌僵直、构音障碍等锥体外系症状、体征或/和肝症状；③肉眼或裂隙灯证实有K-F角膜色素环；④血清铜蓝蛋白＜200mg/L或血清铜氧化酶＜0.2活力单位；⑤24 h尿铜排泄量＞100μg(1.56μmol)；⑥肝铜＞250μg/g(干重)。判断：凡完全具备上述①～③项或l及4项者，可确诊为临床表现型；具备③～⑤者或③～④项者属症状前型。仅有①～②项或①、③项者，应怀疑WD，通过第⑥项确诊。

2 基因检测方法

2.1 家系连锁分析 其原理是将待检家族成员基因与先证者的遗传标记进行基因连锁分析，从而进行诊断。方法包括限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、短串联重复序列(short tandem repeat，STR)和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。1989年Figus等[6]首先采用RFLP法开始了WD的基因诊断，成功地在WD先证者家系中筛选到症状前患者和杂合子。RFLP法是早期的基因检测方法，但因其信息量少等原因而不适用于临床。STR又称微卫星DNA，与RFLP相比，具有分布广泛、高多态性、高杂合性、易于确定基因型等优点。Thomas等[7]利用微卫星DNA对WD患者家系进行分析，表明该标记也可用于WD先证者家系成员的诊断，且检出率更高。国内王丽娟等[8]也利用5个微卫星DNA标记对22个WD进行了单倍体连锁分析，取得了满意的结果。孟晓燕等[9]运用多个短串联重复序列(STR)多态性位点单体型分析析对肝豆状核变性(WD)携带者进行筛查及产前诊断，检测D13S296、D13S301和D13S316 3个位点，证实该方法准确快速。以上方法所用酶DNA遗传标记与WD基因距离较远、重组率高，且必须与同一家系的先证者进行比较，因此不能用于无先证者的拟诊患者。

DNA序列单个碱基的差别可造成DNA片段构象变化而作为多态性标记，称单核苷酸多态性（SNP）。2007年Harmut[10]、Gupta等[11]选择了4个WD基因的SNP位点对印度人WD家系进行检查，检测效果较好，证明SNP具有遗传稳定、重组率低等特点。若将其与PCR、RFLP等方法结合起来可大大提高基因诊断效率。

2.2 聚合酶链反应（PCR）分析技术 PCR分析技术方法包括聚合酶链反应一单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)；PCR酶切和荧光PCR技术，多重PCR等。PCR-SSCP灵敏度较离，适用于单个碱基插入、置换或缺失的检测。操作相对简单费用较低，但由于不能明确突变部位和性质，且易出现假阳性或假阴性结果。多用于突变的筛选，其最终结果需经DNA测序证实。1997年Maier-Dobeersberger等[12]以半巢式PCR酶切分析法率先开展了对WD直接基因诊断的尝试，针对14号外显子His1069Gln进行突变筛选而检出症状前患者和杂合子。此后国内马少春等以Msp I酶切法对8号外显子778密码子突变进行了检测[13]，随后黄帆等以荧光PCR法对Arg778Leu突变进行检测[14]，均取得了满意的结果。国内针对8号外显子的突变热区采用酶切分析、荧光聚合酶链反应等方法进行基因突变位点的检测，阳性检出率为27.00%，39.40%。PCR酶切和荧光PCR技术只能对已知的突变点基因检测，且需要设计针对特异突变的探针，不能检测未知的突变位点，限制了其临床应用。

多重扩增阻滞突变系统PCR（multiplex amplification refractory mutation system PCR，M-ARMS-PCR）：ARMS自1989年问世以来已被用来检测多种基因的已知点突变，其原理是PCR扩增时引物是否能延伸主要取决于引物3’端的1～2个碱基是否与模板配对，如果不配对则引物不能延伸，故只要能设计适当的引物，则可以区别正常和突变的DNA顺序。在ARMS基础上设计多重PCR，可同时检测多种突变。Hassan Dastsooz等[15]使用M-ARMS-PCR筛查ATP7B的常见突变点，其结果证明M-ARMS-PCR高效、准确、费用低廉，可用于临床上筛查ATP7B常见突变点。

2.3 变性高效液相色谱（DHPLC）分析技术 DHPLC于20世纪90年代末出现，其原理是由于同源双链和异源双链二者间双链熔解温度(Tm)的差异，形成不同的色谱峰，从而发现已知的和未知的DNA变异。DHPLC是一种高通量的筛选DNA序列变异的技术，具有较高的敏感性和特异性，且操作简单，有快速、敏感、准确且经济的特点，阳性检出率可达33.32%，但此法不能确定基因突变部位和性质，只适用于大样本筛查。

2.4 DNA测序技术 WD基因全序列检测是目前WD基因诊断中最常用、最准确、最直接的的方法，可确定基因突变的具体位置和性质，是WD基因诊断的金标准。随着分子生物学技术的不断发展，DNA测序不断朝着高通量、高速、自动化的方向发展。目前采用WD全外显子测序进行基因检测的方法已经十分成熟，可以发现各外显子以及其与内含子交界处的突变，检测费用也为多数患者家庭接受。通过精确的临床诊断和迅速的全基因测序，ATP7B基因的突变检测率可达98%[16-17]。但是基因检测对技术人员要求高、设备要求高、在一般医院难以推广。

2.5 DNA微阵列技术 也称为DNA芯片技术，该技术通过将含突变点的及正常的DNA序列片段均集成于一个芯片之上实现对突变的快速准确的检测而完成WD基因诊断。该技术具有高通量、多样化、微量化、集成化等显著优点[18]。Harmut等开发了一种可以检测60种WD基因突变的DNA微阵列芯片，但仍不能包含一些少见的和新发现的突变[10]。

2.6 高分辨率溶解曲线分析（high-resolution melting，

HRM） HRM是于2002年由犹他大学和爱德华科技公司合作开发的应用于SNP检测分析的一项新技术。其原理是基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线。相较于传统的基因检测技术，HRM不仅据有极高的特异性和理想的灵敏度，而且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限，并且实现真正无污染的闭管操作。在突变扫描、单核苷酸多态性分析、甲基化研究、基因分型、序列匹配等方面HRM分析技术发挥着重要作用。Chin-Wen Lin等[19]用HRM法筛查台湾地区14名WD患者及50名正常人的ATP7B基因，发现10种不同的热点突变及7种基因多态性，并在50名正常人种发现一种新的变异序列(p.A476T)及一种新的基因多态性(p.L776L)，此结果经直接DNA测序得以证实。

3 小结

ATP7B基因位于13q14.3，全长约80kb，包含21个外显子20个内含子、4.3kb编码区，以点突变为主，至今为止已发现600多种突变，大多是杂合突变[20]，了解这些突变谱对基因检测至关重要。WD分子遗传学检测面临的主要困难是检测的灵敏度和如何从良性序列中识别出致病性序列。Kenney SM等[21]于2007年报道在WD的518种突变中，379种是致病性的，139种为非致病性的，还有一些突变体尚不能确定是否致病。

毫无疑问，上述的基因诊断方法对铜生化检测难以确诊的临床WD患者及症状前患者或杂合子的检出取得了一定的效果。但由于突变类型的复杂多样，有相当部分患者难以检出。而一种理想的诊断方法应有很高的诊断率和尽可能低的误诊率（假阳性）及漏诊率（假阴性）。

除WD基因本身异常外，其调控或表达异常也会致病。WD基因本身存在选择性剪切现象，且有些基因突变对基因表达并无影响[22]，因而对WD基因表达产物的数量和结构进行检测可能更有意义。通过对mRNA的检测，可以了解有无WD基因的转录及加工缺陷等。另外，即使WDmRNA的转录完全正确，WD的正确表达还有赖于正确的翻译及翻译后加工（糖基化）。因此WD蛋白分子水平检测判断其含量，结构与功能有无异常也许是WD分子水平诊断的最佳发展方向。

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10.3936/j.issn.1002-0152.2014.04.015

☆ 安徽省卫生厅医学科研课题（编号：2010B003）*

安徽省立医院神经内科（合肥230001）

（E-mail:tqq1995＠126.com）△亳州市第一人民医院

R742.4 (

2013-08-02）

A （责任编辑:李立）

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