Bcl-x mRNA前体剪接转换寡核苷酸诱导胶质瘤细胞凋亡的实验研究*

李朝晖 田 男 付 红 李妍哲 韩 亮 田 宇

Bcl-x mRNA前体剪接转换寡核苷酸诱导胶质瘤细胞凋亡的实验研究*

李朝晖①田 男②付 红①李妍哲①韩 亮①田 宇①

目的：探讨Bcl-x mRNA前体剪接转换寡核苷酸（Bcl-x splice-switching oligonucleotides，Bcl-x SSO）对胶质瘤细胞株U251增殖和凋亡的影响。方法：设计靶向Bcl-x基因下游选择性5'端剪接位点的Bcl-x SSO，β-globin SSO作为阴性对照SSO。SSO经2'-甲氧乙基（2'-O-methoxyethyl，MOE）、全硫代磷酸化（phosphorothioate，PS）修饰。采用阳离子脂质体将不同的SSO转染至U251细胞。采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）检测Bcl-x SSO对U251细胞的增殖抑制率。流式细胞术定量检测U251细胞的凋亡率。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测Bcl-x SSO对Bcl-xL、Bcl-xS mRNA表达水平的影响，Western blot方法检测Bcl-x SSO对Bcl-xL、Bcl-xS蛋白表达的影响。结果：MTT结果显示Bcl-x SSO显著抑制U251细胞的增殖，且抑制作用呈剂量依赖性。流式细胞术检测Bcl-x SSO能够明显促进U251细胞凋亡。RT-PCR检测Bcl-x SSO处理组Bcl-xL mRNA表达水平下降，Bcl-xS mRNA表达水平升高。Western blot检测Bcl-x SSO处理组Bcl-xL蛋白表达水平下降，Bcl-xS蛋白表达水平升高。结论：在胶质瘤细胞U251中，Bcl-x SSO可特异性的作用于Bcl-x mRNA前体，调节其选择性剪接模式从Bcl-xL转换至Bcl-xS，进而促进U251细胞凋亡。

选择性剪接 寡核苷酸 凋亡 流式细胞术 胶质瘤细胞

随着对肿瘤病因的不断深入研究，发现多种基因mRNA前体通过选择性剪接可产生两种或多种具有不同功能的蛋白，不同选择性剪接异构体比值的改变与肿瘤的发病机制相关［1-3］。其中Bcl-x是凋亡基因Bcl-2家族成员之一，通过选择性剪接产生抗凋亡作用的Bcl-xL和促凋亡作用的Bcl-xS两种作用相拮抗的蛋白。Bcl-x的选择性剪接模式在多种肿瘤包括胶质瘤中存在异常，表现为Bcl-xL表达水平升高，同时Bcl-xS表达水平下调［4-5］。

SSO能够与pre-mRNA上特异的序列结合，通过封闭靶mRNA上特定的序列阻碍其中一种特定的剪接，从而调节剪接方式的转换。针对Bcl-x基因的Bcl-x SSO被证实能够通过调节选择性剪接，在体外和体内均能有效抑制乳腺癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤的生长［6-8］。

本研究利用阳离子脂质体介导Bcl-x SSO转染胶质瘤细胞株U251，特异性的封闭下游选择性5'端剪接位点，将其剪接模式从Bcl-xL转换至Bcl-xS。通过调控Bcl-x pre-mRNA选择性剪接从而诱导胶质瘤细胞凋亡，为胶质瘤的基因治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 人胶质瘤细胞株U251购自中科院上海细胞所。DMEM高糖培养基、含EDTA胰酶购于南京凯基生物科技发展有限公司。胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物制品公司。MTT、DMSO购自杭州昊天生物公司。Trizol试剂、Lipofectamine 2000试剂由美国Invitrogen公司提供。SuperRT cDNA第一链合成试剂盒、Ultra SYBR购于北京康为世纪生物科技有限公司。Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。RIPA裂解液、兔抗人Bcl-xL、Bcl-xS抗体及抗兔二抗均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.2 仪器 美国Quawell超微量紫外分光光度计，美国SpectraMax多功能酶标仪，德国Eppendorf PCR仪，美国Guava Easy Cyte微毛细管流式细胞分析仪，美国Aplegen OmegaLum G高分辨率凝胶成像仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 U251细胞常规培养于含10%灭活胎牛血清、青霉素100 IU/mL、链霉素100 μg/mL的DMEM培养基中，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。0.25%胰蛋白酶消化传代。

SSO合成、修饰、纯化、备用。Bcl-x SSO序列为5'-TGGTTCTTACCCAGCCGCCG-3'；β-globin SSO作为阴性对照SSO（Control SSO），序列为5'-GCTAT TACCTTAACCCAG-3'。SSO均经MOE及PS修饰。SSO由上海生工生物工程有限公司合成并纯化。采用Lipofectamine 2000试剂并参照说明书操作进行转染。

1.2.2 MTT检测细胞增殖活性 取对数生长期的U251细胞以5×104/mL密度接种于96孔培养板，100 μL/孔。待细胞增至80%～90%时，转染不同浓度的SSO，使其终浓度分别为0、25、50、100、200、400、 800 nM（0 nM为对照组），每个浓度组设5个复孔，放入细胞培养箱中培养48 h后，每孔加入10 mg/mL的MTT 10 μL，继续培养4 h后，吸除孔内培养基，加入150 μL//孔DMSO，低速摇床10 min，使其充分溶解，酶标仪检测各孔490 nm波长吸光度OD值。细胞增殖抑制率=（对照组OD值-试验组OD值）/对照组OD值×100%。

1.2.3 流式细胞术分析细胞凋亡 浓度200 nM的Bcl-x SSO和Control SSO分别转染U251细胞后48 h，收集细胞。PBS离心洗涤2次，重悬于500 μL的Binding Buffer溶液中，细胞筛过筛，加入5 μL Annexin V和5 μL PI染色液后混匀，室温下孵育15 min，标本用流式细胞仪分析。

1.2.4 RT-PCR检测 浓度200 nM的Bcl-x SSO和Control SSO分别转染U251细胞后48 h，Trizol试剂提取总RNA。SuperRT cDNA Kit试剂盒合成第一链cDNA。GoldStar Best Taq DNA Polymerase扩增Bcl-xL及Bcl-xS，分别在剪接位点的上游和下游设计引物。序列为∶Forward 5'-AGTAAAGCAAGCGCTGAGGGAG-3'，Reverse 5'-ACTGAAGAGTGAGCCCAGCAGA-3'，扩增片段Bcl-xL为452 bp，Bcl-xS为250 bp。引物由南京金斯瑞生物有限公司合成。反应体系为50 μL，包括5× Gold Star Best Taq PCR Buffer 10 μL，dNTP Mix（2.5 mM）4 μL，GoldStar Best Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.5 μL，cDNA 2 μL，Primer Forward 1 μL，Primer Reverse 1 μL，添加去离子水使总体积达到50 μL。RT-PCR反应条件∶95℃，10 min；94℃，30 s，58℃，30 s，72°C，60 s，40个循环；72°C，10 min。扩增产物进行凝胶电泳，割胶分离大小不同的两条带，快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物，琼脂糖凝胶电泳鉴定。双向测序，测序工作由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2.5 Western blot检测 浓度200 nM的Bcl-x SSO和Control SSO分别转染U251细胞后48 h，RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法检测蛋白含量。15%SDS-PAGE凝胶电泳，电转至硝酸纤维素膜。含5%脱脂奶粉的TBS封闭，1：100稀释的Bcl-xL和Bcl-xS兔抗人多克隆抗体4℃孵育过夜，HRP标记的抗兔IgG孵育，DAB显色。Bcl-xL和Bcl-xS相对分子质量分别为30 kD和21 kD。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行分析。组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。数据以±s表示。

2 结果

2.1 Bcl-x SSO对胶质瘤细胞体外增殖的抑制作用

不同浓度的Bcl-x SSO和Control SSO转染U251细胞后继续培养48 h，Bcl-x SSO组细胞增殖受到明显抑制，细胞增殖抑制率随Bcl-x SSO浓度增加而增高，呈浓度依赖性。Control SSO组细胞增殖仅受到轻度抑制，考虑为脂质体对细胞的损伤作用所致。Bcl-x SSO组和Control SSO组两组之间的抑制率存在显著性差异（P＜0.01，表1）。

2.2 Bcl-x SSO对胶质瘤细胞凋亡的影响

各组U251细胞FITC/PI双染结果显示∶Bcl-x SSO组细胞凋亡率明显高于空白对照组和Control SSO组。Control SSO组细胞凋亡率与空白对照组相比无明显增加（图1）。

2.3 Bcl-x SSO对胶质瘤细胞 Bcl-xL和Bcl-xS mRNA表达的影响

RT-PCR在不同的组别均检测到分子量大小不等的两条条带（图2），电泳产物切胶回收纯化后测序，分别和Bcl-xL（452 bp）和Bcl-xS（250 bp）的mRNA序列相符。Bcl-x SSO组与空白对照组相比，Bcl-xL mRNA表达水平下降，Bcl-xS mRNA表达水平升高，Bcl-xS/ Bcl-xL明显增高。Control SSO组Bcl-xL和Bcl-xS mRNA表达水平与空白对照组比较无明显变化。

2.4 Bcl-x SSO对胶质瘤细胞Bcl-xL和Bcl-xS蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，Bcl-x SSO组与空白对照组相比，Bcl-xL蛋白表达水平下降，Bcl-xS蛋白表达水平升高。Control SSO组Bcl-xL和Bcl-xS蛋白表达水平与空白对照组比较无明显变化（图3）。

3 讨论

mRNA选择性剪接在真核细胞中普遍存在，被公认为是高等生物增加蛋白质组多样性的主要机制。选择性剪接受到精密的调控，在不同的组织细胞、不同的发育阶段和不同的外界环境下表现出特定的剪接模式。选择性剪接异常可通过影响肿瘤细胞的周期调节、信号转导通路、凋亡、血管生成、侵袭和转移等参与肿瘤的发生发展过程［9-11］。凋亡调控基因Bcl-x mRNA前体的选择性剪接是目前研究最为广泛的，Bcl-x mRNA前体通过选择性剪接产生两种转录本，分别编码Bcl-xL和Bcl-xS两种蛋白，Bcl-xL具有抗凋亡作用，而Bcl-xS具有促凋亡作用［4-5］。在前列腺癌、乳腺癌、胶质瘤等多种肿瘤中均检测到Bcl-xL和Bcl-xS比例的失调［10-11］。

Pre-mRNA选择性剪接产物比值改变的现象，使其成为开发剪接模式药物的理想靶点。Pre-mRNA的剪接反应在剪接体中执行，剪接体是由5个小分子细胞核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoproteins，snRNPs）以及200多种剪接因子（splicing factor）组成的大分子复合物。SSO与肿瘤相关基因pre-mRNA上特异的序列如剪接位点、剪接增强子或剪接沉默子杂交，这种杂交阻止snRNP与该核苷酸序列结合，使剪接体从一个剪接点移到另一个剪接点，调节不同剪接方式的转换［1-2］。

针对Bcl-x剪接设计的SSO特异性的结合Bcl-x基因内含子2中5'端剪接位点，能够调节Bcl-x mRNA前体的选择性剪接，使剪接方式由Bcl-xL向Bcl-xS转换，从而促进肿瘤细胞凋亡。体内外实验已经证实Bcl-x SSO能够有效抑制乳腺癌、前列腺癌及转移性黑色素瘤，具有抗肿瘤活性［6-8］。本研究设计靶向Bcl-x基因内含子2中5'端剪接位点的SSO，利用脂质体将其转染至胶质瘤细胞U251，MTT结果显示Bcl-x SSO对胶质瘤细胞U251有增殖抑制作用，且呈浓度依赖性。流式细胞仪检测显示Bcl-x SSO能够显著促进胶质瘤细胞U251凋亡。RT-PCR和Western blot分别从RNA和蛋白水平上证实Bcl-x SSO作用后，Bcl-xL表达下调的同时Bcl-xS的表达上调。Bcl-x SSO通过将Bcl-x的剪接模式从Bcl-xL转换至Bcl-xS，从而发挥抗肿瘤作用。

SSO与传统的反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，AO）和siRNA不同，传统的AO与mRNA杂交后诱导核糖核酸酶H（ribonuclease H，RNase H）裂解靶mRNA，siRNA通过形成沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）降 解 靶mRNA。SSO并不降解靶mRNA，其通过封闭靶mRNA上特定的序列阻碍其中一种特定的剪接，从而调节剪接方式的转换［12-13］。对SSO的要求是在细胞中具有较高的稳定性，自身不被核酸酶降解，能够与靶Pre-mRNA牢固的结合，同时又不激活RNase［14-15］。本研究对SSO进行MOE、硫代磷酸化修饰。MOE修饰的寡核苷酸能够稳定的与靶序列形成杂交体，不会被选择细胞内的RNase水解，并且能进入前体mRNA剪接所在的细胞核中。硫代磷酸化修饰能够增加SSO的自身稳定性。

作为一种调控机制，选择性剪接对调控信号起到放大作用。选择性剪接模式改变后，抗凋亡基因Bcl-xL浓度下降的同时引起促凋亡基因Bcl-xS浓度上升，使Bcl-xS/Bcl-xL比值明显升高。而反义治疗中单个基因产物的转录调控只会引起单个基因表达水平的改变。因此，Bcl-x SSO对胶质瘤的促凋亡效果理论上明显高于Bcl-xL反义寡核苷酸。Bcl-x SSO有望成为胶质瘤治疗的新方法。

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（2013-12-23收稿）

（2014-02-26修回）

（本文编辑∶杨红欣）

Apoptosis-promoting effect of splice-switching oligonucleotides targeting Bcl-x pre-mRNAof the human glioma cell line

Zhaohui LI1,Nan TIAN2,Hong FU1,Yanzhe LI1,Liang HAN1,Yu TIAN1
Correspondence to:Yu TIAN;E-mail:tianyu2801@126.com

1Department of Neurosurgery,China-Janpan Union Hospital of Jilin University,Changchun,130031,China；2Department of Cell Biology,College of Life Science,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou,310053,China

This work was supported by The National Natural Science Foundation of China(No.30672159),"Program for New Century Excellent Talents,"Ministry of Education of China(No.NCET-06-0306),and Jilin Provincial Science and Technology Development Plan of International Science and Technology Cooperation Projects(No.20130413028GH)

Objective:To investigate the proliferation inhibition and apoptosis-promoting effects of splice-switching oligonucleotides targeting the Bcl-x pre-mRNA(Bcl-x SSO)of the human glioma cell line U251.Methods:Bcl-x SSO was designed to bind to the 5'-splice site of exonⅡin Bcl-x pre-mRNA.An oligonucleotide targeted to aberrantly splice human β-globin intron was used as a control SSO.SSOs were modified using 2'-O-methoxyethyl and phosphorothioate,and were delivered together with lipofectamine into the human glioma cell line U251 via cationic liposomes.The proliferation inhibition rate of the cell human cell line U251 was assessed via MTT assay.Flow cytometry was performed to detect the apoptosis rate.Modulation from Bcl-xL to Bcl-xS was analyzed via reverse transcription polymerase chain reaction and Western blot.Results:The study showed that Bcl-x SSO caused proliferation inhibition and induced apoptosis in a dose-dependent manner in the human glioma cell line U251,whereas the control SSO did not show any evident effect.The expression of Bcl-xL mRNA and protein increased,whereas the expression level of Bcl-xS mRNA decreased in the human glioma cell line U251 treated with Bcl-x SSO.Conclusion:The study demonstrated that Bcl-x SSO can induce apoptosis in human glioma cell line U251.The mechanism involves the redirection of Bcl-x splicing from Bcl-xl to Bcl-xs.Bcl-x SSOs have the potential to be used as anti-cancer drugs for glioma therapy.

alternative splicing,oligonucleotides,apoptosis,flow cytometry,glioma cell line

10.3969/j.issn.1000-8179.20132178

李朝晖 博士，主治医师，研究方向为胶质瘤的发病机理及基因治疗。

①吉林大学白求恩医学部中日联谊医院神经外二科（长春市130031）；②浙江中医药大学生命科学学院

*本文课题受国家自然科学基金（编号：30672159），教育部“新世纪优秀人才支持计划”（编号：NCET-06-0306）及吉林省科技发展计划国际科技合作项目（编号：20130413028GH）资助

田宇 tianyu2801@126.com

E-mail∶ruosong@163.com