B7家族及其受体PD-1在人NK/T细胞淋巴瘤中的表达及临床意义*

韩丽娟 李汝平 陈新峰 张旭东 孙素珂 文建国 张明智

·临床研究与应用·

B7家族及其受体PD-1在人NK/T细胞淋巴瘤中的表达及临床意义*

韩丽娟①李汝平①陈新峰①张旭东①孙素珂②文建国②张明智①

目的：探讨B7家族及其受体（programmed death-1，PD-1）在人NK/T细胞淋巴瘤（NKTL）中的表达及临床意义。方法：荧光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，RQ-PCR）及免疫组织化学SP法检测PD-1及B7家族PD-L1、PD-L2在人NKTL细胞系（SNK-6、YTS）及NKTL组织中的表达，并分析其与临床病理学参数及临床疗效之间的关系。结果：PD-L1和PD-L2 mRNA在SNK-6、YTS中的表达明显高于正常NK细胞。PD-L1和PD-L2蛋白在NKTL组织中的表达阳性率（分别为60.0%、63.3%）明显高于鼻炎组织（22.2%、16.7%）；NKTL组织中PD-1+肿瘤浸润T淋巴细胞（TIL）数与PD-L1、PD-L2的表达均呈负相关；PD-L1和PD-L2的表达水平与分期均呈正相关，PD-L1与LDH、Ki-67水平呈正相关，PD-L1与IPI评分呈负相关，PD-L1及PD-L2与其他临床病理学参数无显著相关性。PD-L1与治疗疗效呈负相关，而PD-L2与治疗疗效无明显相关性。结论：B7家族及其受体PD-1在人NKTL中高表达且具有一定的临床意义，PD-L/PD-1信号途径可能参与了NKTL的免疫逃逸，有望成为人NKTL免疫治疗的新靶点。

淋巴瘤 PD-L1 PD-L2 PD-1 NK细胞

1Department of Oncology,The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,China；2Institute of Clinical

Medicine,The FirstAffiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,China

This work was supported by The National Natural Science Foundation of China(No.81172118)

NK/T细胞淋巴瘤（NKTL）是非霍奇金淋巴瘤的一个亚型，中国发病率远高于西方国家，占恶性淋巴瘤的3%～8%，具有特殊形态、免疫表型和高度侵袭性，与EB病毒感染密切相关［1-3］。到目前为止，NKTL尚无标准治疗方案，疗效及预后较差，其原因之一可能为淋巴瘤细胞通过某种机制逃避机体的免疫监视和杀伤。B7-CD28家族共刺激分子在T细胞的激活和耐受中起到了关键作用，而PD-L1（B7-H1/CD274）和PD-L2（B7-DC/CD273）是B7家族共刺激分子重要成员，研究发现它们通过与其受体PD-1相互作用，传递负性调控信号诱导肿瘤抗原特异性T细胞的凋亡和免疫无能，促使肿瘤的免疫逃逸［4-6］。研究考虑NKTL肿瘤细胞可能通过B7家族共刺激分子与其受体PD-1相互作用介导其免疫逃逸，促进淋巴瘤的发生发展。本文研究并报道了B7家族（PD-L1、PD-L2）及其受体PD-1在NKTL中的表达，并探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系及其培养 人NKTL细胞系SNK-6由日本千叶大学Norio Shimizu教授惠赠，正常NK细胞由郑州大学第一附属医院生物治疗中心提供；SNK-6和正常NK细胞用含10%人AB血清、1 000 U/mL白介素2（IL-2）的RPMI 1640培养基培养、YTS细胞由美国梅奥医学中心Scott Kaufmann教授惠赠；用含1%非必需氨基酸、10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养。细胞系均置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，2～3d换液一次。取对数生长期的细胞进行实验。

1.1.2 标本来源 收集郑州大学第一附属医院病理科2011年3月至2012年4月间NKTL石蜡包埋组织30例，男21例，女9例，年龄15～68岁，平均47岁，病变均位于鼻腔；取同期的18例慢性鼻炎组织作为对照，男10例，女8例，年龄12～76岁，平均52岁。淋巴瘤分类按照2008年WHO淋巴造血组织肿瘤分类进行；临床分期按照AnnArbor分期∶Ⅰ期6例，Ⅱ期15例，Ⅲ期5例，Ⅳ期4例；实验入选标准∶1）经病理学证实为NKTL；2）均未接受过放、化疗；3）临床、病理学资料完整。免疫组织化学切片均由2名资深的病理学专家双盲评估。本研究获得本院伦理学委员会许可。

1.1.3 主要试剂 RPMI1640培养基购自Solarbio公司；无支原体胎牛血清购自杭州四季青公司；人AB血清由河南省中心血站提供；RNA提取试剂盒购自北京天根生物公司；逆转录试剂盒购自Fermentas；引物由上海生工合成；SYBR Green Mixture购自北京康为世纪生物公司；鼠抗人PD-1单克隆抗体及兔抗人PD-L2多克隆抗体、免疫组织化学SP染色试剂盒和DAB显色剂均购自北京中杉金桥有限公司；兔抗人PD-L1多克隆抗体购自武汉三鹰生物公司。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及逆转录 取对数生长期细胞5× 106个/mL，按离心柱法RNA提取试剂盒说明书操作，经RNA纯度检测所有样品的D260/D280均在1.85～2.00之间。逆转录按Fermentas逆转录试剂盒说明书进行，反应条件为42℃60 min、70℃5 min、4℃pause。所得cDNA产物-20℃保存备用。

1.2.2 RQ-PCR检测B7家族PD-L1、PD-L2 mRNA的相对表达量 按SYBR Green Mixture试剂盒操作程序。以正常NK细胞的β-actin为内参照，引物序列为∶PD-L1∶F15'-CAT CTT ATT ATG CCT TGG TGT AGC A-3'，R15'-GGA TTA CGT CTC CTC CAA ATG TG-3'；PD-L2∶F15'-CAA CTT GGC TGC TTC ACA TTT T-3'，R15'-TGT GGT GAC AGG TCT TTT TGT TGT-3'；β-actin∶F15'-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3'，R15'-CTG GAA GGT GGA CAG GG-3'。扩增产物分别为146、110、205 bp。反应条件为先预变性95℃10 min，后变性95℃15 s，变性/延伸60℃1 min，共40个循环；溶解曲线分析95℃15 s、60℃1 min、95℃15 s、60℃15 s，得到相应的Ct值，用ABI 7 500 Fast System软件进行相对定量分析，实验重复三次。

1.2.3 免疫组织化学SP法检测PD-1、PD-L1、PD-L2蛋白表达 石蜡包埋组织切片，常规脱蜡，置于0.01 mol/L pH 6.0的柠檬酸盐95℃高压锅15 min抗原修复，冷却至室温后PBS冲洗、暴露抗原、H2O2处理，兔抗人PD-L1多克隆抗体（1∶120稀释）、抗PD-1单克隆抗体（1∶100稀释）及抗PD-L2多克隆抗体（1∶150稀释）4℃孵育过夜，PBS代替一抗作阴性对照；二抗孵育30 min后DAB显色、苏木素复染、盐酸酒精分化、透明，最后中性树胶封片。

1.2.4 免疫组织化学结果判断标准 PD-L1、PD-L2、PD-1均以细胞膜和胞质中出现明显棕黄色者为表达阳性，均在高倍镜下随机选择5个视野计数阳性细胞数，每个视野至少计数200个细胞。参照肿瘤组织中PD-L1、PD-L2表达的计数方法［13-15］，结合染色强度和阳性细胞百分比来评定阳性病例。肿瘤组织中PD-L1和PD-L2阳性细胞染色强度分级∶无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；5个视野阳性细胞平均百分数作为该例阳性细胞百分比，将其分级∶＜10%1分，10%～50% 2分，＞50%3分。两项结果相乘得分＞3分为阳性，＜3分为阴性。对PD-1阳性细胞计数∶将5个视野阳性细胞平均数作为该例表达阳性数，再以30例PD-1阳性细胞平均数作为阈值，将病例分为高PD-1+TIL浸润组和低PD-1+TIL浸润组。

1.2.5 临床疗效评价标准 30例NKTL患者均在治疗4个周期进行疗效评价，将疗效分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、疾病稳定（SD）、疾病进展（PD）。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 RQ-PCR检测结果

用RQ-PCR对NKTL细胞系B7家族PD-L1和PD-L2的表达进行相对定量分析，获得单峰溶解曲线，显示扩增产物为特异序列（图1）。SNK-6和YTS中PD-L1和PD-L2的表达量均明显高于正常NK细胞（P＜0.05，图2，表1）。

2.2 免疫组织化学检测结果

免疫组织化学结果（图3）显示PD-L1、PD-L2蛋白均定位在肿瘤细胞和间质细胞的胞质和胞膜，而PD-1定位在肿瘤间质淋巴细胞胞质和胞膜上。NKTL肿瘤细胞PD-L1和PD-L2的阳性率分别为60.0%（18/30）、63.3%（19/30），而鼻炎组织阳性率分别为22.2%（4/18）、16.7%（3/18），差异均具有统计学意义（P＜0.05）。NKTL组织中PD-1+TIL细胞数在0～18个之间，平均7.56个；鼻炎组织PD-1+TIL细胞数在0～9个之间，平均1.33个，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 SNK-6和YTS中PD-L1、PD-L2 mRNA的相对表达量（±s）Table 1 The relative expression of PD-L1，PD-L2 mRNA in SNK-6 and YTS cells（±s）

Cell line NKTL SNK-6 YTS PD-L1 Relative expression 1.00±0.00 8.51±3.23 5.49±1.98 P P 0.016 0.017 PD-L2 Relative expression 1.00±0.00 4.71±0.86 8.99±1.22 0.002 0

2.3 NKTL组织中PD-L1、PD-L2的表达和PD-1+ TIL的相关性

以NKTL组织中PD-1+TIL均数7.56为阈值分组，PD-1+TIL高浸润组16例和低浸润组14例。经χ2检验分析，NKTL组织中PD-L1、PD-L2的表达水平和PD-1+TIL均呈负相关（均P＜0.05，表2）。

2.4 NKTL组织PD-L1和PD-L2蛋白的表达与临床病理学参数的关系

如表3所示，PD-L1和PD-L2的表达水平与分期均呈正相关（P＜0.05），PD-L1与LDH、Ki-67水平均呈正相关（P＜0.05），PD-L1与IPI评分呈负相关（P＜0.05），PD-L2与IPI评分、LDH、Ki-67水平均无相关性（P＞0.05），两者与性别、年龄、β2-MG水平均无显著相关性（P＞0.05）。

2.5 PD-L1和PD-L2蛋白的表达与NKTL临床疗效的相关性

PD-L1与临床疗效呈负相关（P＜0.05），而PD-L2与临床疗效无明显相关性（P＞0.05，表4）。

3 讨论

B7家族是唯一能从抗原提呈细胞（APC）单向传递信号至T细胞的共刺激分子，目前研究发现其成员有8种∶CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD274（PD-L1/ B7-H1）、CD273（PD-L2/B7-DC）、CD275（ICOS-L）、CD276（B7-H3）、B7-H4和B7-H6［7-8］。PD-L1主要在APC、激活的T、B细胞和人类肿瘤细胞上表达［9］。PD-L2和PD-L1结构、基因序列和功能相似，PD-L2不仅在APC，而且在T细胞和TH2细胞中诱导性表达［10］。PD-1是CD28共刺激受体超家族成员，其结构类似于细胞毒性淋巴细胞抗原4（CTLA-4）［11］，主要在活化的T细胞特别是CD8+TIL、B细胞、髓细胞和胸腺细胞中表达［9，16］。

在恶性黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、血液系统恶性肿瘤等肿瘤中，PD-L1高表达且参与肿瘤细胞的免疫逃逸［12］。但大多数文献仅关注肿瘤细胞PD-L1的表达及功能意义，而忽视了PD-L2所扮演的角色。Iwamura等［6］研究发现PD-L2和T细胞受体结合后抑制T细胞IFN-r的分泌，而沉默PD-L2 siRNA后其负性效应解除，这高度提示PD-L2可能通过传递负性调控信号调节T细胞功能，因此，PD-L2在肿瘤微环境中的作用应得到重视。本研究同时检测了NKTL中PD-L1和PD-L2的表达，结果发现PD-1、PD-L1和PD-L2在SNK-6、YTS及NKTL组织中均呈不同程度的高表达，PD-L1和PD-L2不仅在肿瘤细胞也在肿瘤浸润淋巴细胞及巨噬细胞的胞质和胞膜表达，而PD-1主要表达在肿瘤间质淋巴细胞的胞质和胞膜。

研究发现，非小细胞肺癌组织中PD-L1表达与肿瘤分期、淋巴结转移及PD-1+TIL均呈正相关［13］。胃癌中PD-L1的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、分期相关，且与PD-1+TIL呈负相关［14］。本研究发现NKTL组织中PD-L1和PD-L2的表达水平与分期均呈正相关，PD-L1与LDH、Ki-67水平均呈正相关，PD-L1与IPI评分呈负相关，PD-L1及PD-L2与其他临床病理学参数均无显著相关性。而PD-L1和PD-L2的表达与PD-1+TIL的分布均呈负相关。肿瘤组织浸润T淋巴细胞（TIL）反映了机体抗肿瘤的总体水平，在NKTL微环境中肿瘤细胞可能通过PD-L/ PD-1途径抑制TIL活性或促进其凋亡，最终导致淋巴瘤细胞的免疫逃逸［15，16］。

本研究充分显示B7家族及其受体PD-1在NKTL中高表达，且具有一定的临床意义，进一步推测PD-L/PD-1信号途径可能参与了NKTL的免疫逃逸，为揭示NKTL细胞免疫缺陷机制提供了重要线索，有望成为NKTL免疫治疗的新靶点。

1 Harabuchi Y,Takahara M,Kishibe K,et al.Nasal natural killer (NK)/T-cell lympho-ma:clinical,histological,virological,and genetic features[J].Int J Clin Oncol,2009,14(3):181-190.

2 Kim SJ,Kim WS.Treatment of localized extranodal NK/T cell lymphoma,nasal type[J].Int J Hematol.2010,92(5):690-696.

3 Roman E,Smith AG.Epidemiology of lymphoma[J].Histopathology,2011,58(1):4-14.

4 Blank C,Kuball J,Voelkl S,et al.Blockade of PD-L1(B7-H1) augments human tumor-specific T cell responses in vitro[J].Int J Cancer,2006,119(2):317-327.

5 Yamamoto R,Nishikori M,Kitawaki T,et al.PD-1-PD-1 ligand interaction contributes to immunosuppressive microenvironment of Hodgkin lymphoma[J].Blood,2008,111(6):3220-3224.

6 Iwamura K,Kato T,Miyahara Y,et al.siRNA-mediated silencing of PD-1 ligands enhances tumor-specific human T-cell effector functions[J].Gene Ther,2012,19(10):959-966.

7 Greaves P,Gribben JG.The role of B7 family molecules in hematological maligna-ncy[J].Blood,2013,121(5):734-744.

8 Li Y,Wang J,Ke XY,et al.Research Update on PD-1/PD-L1 Pathway in Hematological Diseases[J].Journal of Experimental Hematology 2011,19(6):1523-1527.[李 义,王 晶,克晓燕,等.PD-1/ PD-L1通路在血液系统疾病中的研究进展[J].中国实验血液学杂志,2011,19(6):1523-1527.]

9 Li Y,Wang J,Li C,et al.Contribution of PD-L1 to oncogenesis of lymphoma and its RNAi-based targeting therapy[J].Leuk Lymphoma,2012,53(10):2015-2023.

10 Rozali EN,Ha to SV,Robinson BW,et al.Programmed Death Ligand 2 in Cancer-Induced Immune Suppression[J].Clin Dev Immunol,2012,2012:656340.

11 Ishida Y,Agata Y,Shibahara K,et al.Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily,upon programmed cell death[J].EMBO J 1992,11(11):3887-3895.

12 Sznol M,Chen L.Antagonist Antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1)in the Treatment of Advanced Human Cancer[J].Clin Cancer Res,2013,19(5):1021-1034.

13 Ma W,Luo DZ,Chen Y,et al.Expression and clinical significance of PD-L1 and PD-1 in non-small cell lung cancer[J].Journal of Practical Medicine.2011,27(9):1551-1554.[马 薇,罗殿中,陈 源,等.PD-L1和PD-1在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义[J].实用医学杂志,2011,27(9):1551-1554.]

14 Liu SM,Meng Q,Zhang QX,et al.Expression and significance of B7-H1 and its receptor PD-1 in human gastric carcinoma[J].Chin J Oncol.2008,30(3):192-195.[刘书漫,孟 青,张钦宪,等.B7-H1及其受体PD-1在胃癌组织中的表达与意义[J].中华肿瘤杂志,2008, 30(3):192-195.]

15 Geng WP,Xu M,Wang YQ,et al.Expression and significance of co-stimulatory molecules PD-L1,PD-L2 and B7-H4 in human cervical cancer.Journal of Chongqing Medical University.2011,36 (10):1186-1190.[耿卫朴,徐 曼,王渝琦,等.共刺激分子PD-L1、PD-L2和B7-H4在人子宫颈癌的表达及意义[J].重庆医科大学学报,2011,36(10):1186-1190.]

16 Lyford-Pike S,Peng S,Young GD,et al.Evidence for a role of the PD-1:PD-L1 pathway in immune resistance of HPV-associated head and neck squamous cell carcinoma[J].Cancer Res,2013,73(6): 1733-1741.

（2013-06-13收稿）

（2013-10-12修回）

（本文编辑∶贾树明）

The expression and clinical significance of B7 family molecules and their receptor PD-1 in human NK/T-cell lymphoma

Lijuan HAN1,Ruping LI1,Xinfeng CHEN1,Xudong ZHANG1,Suke SUN2,Jianguo WEN2,Mingzhi ZHANG1
Correspondence to:Mingzhi ZHANG;E-mail:mingzhi_zhang1@163.com

Objective:To investigate the expression and clinical significance of B7 family molecules and their receptor PD-1( programmed death-1)in human NK/T-cell lymphoma(NKTL).Methods:Real time fluorescence quantitative PCR(RQ-PCR)and Immunohistochemistry SP method were used to detect the expression levels of PD-1 and B7 family molecules(PD-L1 and PD-L2)in human NKTL cell lines(SNK-6 and YTS)and NKTL tissues.The correlation between these proteins and Clinical histopathological parameters and curative effect were analyzed subsequently.Results:The expression levels of PD-L1 and PD-L2 mRNA in SNK-6 and YTS were significantly higher than that in normal NK cells..The expression of PD-L1 and PD-L2 proteins in human NKTL tissues (60.0%、63.3%)and curative effect were significantly increased compared with rhinitis tissues(22.2%、16.7%);furthermore,the mean count of PD-1+Tumor-infiltrating T lymphocytes(TIL)was inversely correlated with PD-L1 and PD-L2 protein expression levels in NKTL tissues..The expression of PD-L1 and PD-L2 showed a positive correlation with clinical stage..PD-L1 expression was also positively correlated with LDH,Ki-67 level and was negatively correlated with IPI score.However,there were no significant correlation between PD-L1 and PD-L2 with other Clinical histopathological parameters..-PD-L1 expression was negatively correlated with curative effect.However,there was no correlation between PD-L2 expression and curative effect.Conclusion:B7 family molecules and their receptor PD-1 are overexpressed in human NKTL and have greatly clinical significance.PD-L/PD-1 pathway may involved in the tumor immune escape in human NKTL,and it is expected to be a novel target for immunotherapy of human NKTL.

lymphoma,PD-L1,PD-L2,PD-1,NK cell

10.3969/j.issn.1000-8179.20130931

韩丽娟 在读硕士生，研究方向为淋巴瘤的基础与临床研究。

①郑州大学第一附属医院肿瘤内科（郑州市450052）；②河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室

*本文课题受国家自然科学基金项目（编号：81172118）资助

张明智 mingzhi_zhang1@163.com

E-mail∶hanlj2011@163.com