Wnt/β-catenin信号途径促进肌源性干细胞向神经细胞分化

张德龙，王 伟，张 力，李 广，于光明，金 秋辽宁医学院研究生院，辽宁锦州 00；锦州市中心医院辽宁医学院锦州临床学院 骨科，辽宁锦州00

Wnt/β-catenin信号途径促进肌源性干细胞向神经细胞分化

张德龙1，王 伟2，张 力2，李 广1，于光明1，金 秋1
1辽宁医学院研究生院，辽宁锦州 121001；2锦州市中心医院辽宁医学院锦州临床学院 骨科，辽宁锦州121001

目的探讨Wnt/β-catenin信号途径在肌源性干细胞(muscle derived stem cells，MDSCs)分化过程中的调控作用。方法对照组单纯体外培养MDSCs；实验组采用丙戊酸(valproic acid，VA)诱导培养MDSCs分化为类神经细胞；抑制剂组在实验组的基础上采用Dickkopf-1(DKK-1)和sFRP抑制Wnt/β-catenin信号途径。免疫细胞化学检测各组MDSCs的分化情况。RT-PCR检测MDSCs中Wnt3a mRNA表达的变化，Western blot检测MDSCs中GSK-3β、β-catenin蛋白含量的变化。结果实验组和抑制剂组MDSCs经VA诱导后出现神经细胞分化现象，抑制剂组分化水平明显低于实验组，对照组未见分化。与对照组相比，实验组和抑制剂组Wnt3a mRNA和β-catenin表达水平增加，实验组明显高于抑制剂组。实验组和抑制剂组GSK-3β表达水平低于对照组。结论MDSCs向类神经细胞分化过程中Wnt/β-catenin信号通路被激活，Wnt/β-catenin信号通路阻断能够部分抑制MDSCs向类神经细胞分化。

Wnt/β-catenin信号途径；肌源性干细胞；神经分化

近年来，干细胞移植用于各种疾病治疗的研究较为广泛[1]。神经系统退行性疾病，如帕金森病和阿尔茨海默病均可采用细胞移植治疗[2]。肌源性干细胞(muscle derived stem cells，MDSCs)作为一种新近发现的成体干细胞展示了极好的应用前景。其中有关MDSCs诱导分化为类神经细胞的研究报道逐渐增多，使得MDSCs有望成为治疗神经系统退行性疾病的种子细胞[3-5]。但是至今为止，成体干细胞向目的细胞转化的分子机制尚未明确。Wnt/β-catenin信号途径是一种在多细胞生物体内广泛存在，具有高度同源性和进化保守性的信号转导通路。近年来研究显示，其参与生物体的生长、发育、调控，并对多种细胞的分化具有调节作用。其中Wnt/β-catenin信号途径在哺乳动物神经系统发育过程中发挥重要的调节作用[6-7]。此外，众多研究显示Wnt/β-catenin信号途径极有可能在干细胞的神经分化过程中发挥调控作用[8-11]。然而Wnt/β-catenin信号途径是否参与MDSCs的神经分化过程尚未见相关报道。本研究旨在观察体外诱导的MDSCs向神经细胞分化过程中Wnt/β-catenin信号途径相关分子水平的变化，以探索Wnt/β-catenin信号途径在MDSCs向神经细胞分化过程中的调控作用。

材料和方法

1 实验动物 新生2周龄雄性SD大鼠4只，体质量(30±5) g，由辽宁医学院动物实验中心提供。

2 试剂和仪器 胶原酶Ⅺ(Sigma)、分散酶(Invtrogen)、 胰 蛋 白 酶 (Sigma)；10% 马 血 清(Invtrogen)、10%胎牛血清(Hyclone)、0.5%鸡胚提取物(MP Biomedicals)、青霉素和链霉素(Gibco)；碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF ；Invtrogen)、 丙 戊 酸 (valproic acid，VA ；sigma)、Dickkopf-1(DKK1，R&D Systems，USA)、sFRP(PIERCE)；Trizol(MRC， 美 国 )；RT-PCR试剂盒(Takara)；BCA蛋白分析试剂盒(PIERCE)、 抗 GSK-3β、β-catenin一 抗 (Cell Signalling Technology Inc.，Beverly，MA，USA)、抗 β-actin一 抗 (Santa Cruz Biotechnology，CA，USA)，对应二抗 (Rockland Immunochemicals Inc.，Gilbertsville，PA，USA)；抗神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)抗体、抗神经丝(neurofilament，NF)抗体、羊抗兔 IgG，SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德)，DAPI(Anaspec)；荧光显微镜(Olympus)，核酸蛋白浓度分析仪(eppendorf biophotometer)，PCR 仪 (Eppendorf AG22331 Hamburg)，免疫印迹分析仪(Bio-Rad Inc.，Hercules，CA，USA)。

3 MDSCs的体外分离与培养 按照差速贴壁法，以文献[12]方法进行细微修改。脱颈处死大鼠后，无菌条件下取后肢骨骼肌，去除各种黏附组织及脂肪，剪碎肌组织后PBS液冲洗3次。37℃条件下分别采用0.2%胶原酶Ⅺ消化1 h，1 g/L分散酶消化45 min，随后在0.1%胰酶/EDTA溶液中孵育30 min。经250目尼龙筛网过滤。1 500 r/min离心5 min，PBS冲洗沉淀1次，再次离心后重悬于生长培养基(DMEM，10%马血清，10%胎牛血清， 0.5%鸡胚提取物，青霉素100 U/ml和链霉素100 mg/ml)。细胞接种于经胶原预包被的培养瓶中1 h，未贴壁细胞转入新的预包被培养瓶中继续贴壁，24 h后收集未贴壁细胞，离心后继续差速贴壁，接下来每24 h差速贴壁一次，连续5 d。获取的MDSCs于37℃，5% CO2培养箱中培养至90%细胞融合。取传代培养至5～10代的细胞用于实验。

4 MDSCs的诱导分化 MDSCs接种于24孔板，细胞密度为6×103/孔。常规培养24 h后将MDSCs分为3组，对照组细胞继续采用常规生长培养基培养。参照Kwon等[13]的方法，实验组常规培养24 h后更换含有10 μg/L bFGF的生长培养基。预诱导12 h后更换为VA诱导培养基(VA浓度为1 mmol/L的生长培养基)诱导培养。抑制剂组在实验组的基础上向培养基中加入100 μg/L DKK-1和sFRP[14-15]。

5 细胞形态观察 诱导培养1 d、4 d后分别采用倒置相差显微镜观察各组MDSCs的形态变化。

6 Real-time PCR检测MDSCs中Wnt3a mRNA表达水平 提取1×106个细胞所含总RNA。500 ng RNA经逆转录产生cDNA。PCR反应在20 μl反应体系中进行，其中含有cDNA模板(相当于100 ng总RNA)，0.4 μmol/L各个正向和反向引物以及2×SYBR Green PCR Master Mix。DNA于95℃变性5 min，随后95℃ 5s，60℃ 30 s PCR扩增。引物序列如下：Wnt3a(正向：5'-CCA TCC TCT GCC TCA AAT TC-3'； 反 向：5'-TGG ACA GTG GAT ATA GCA GCA-3'；预期产物 74 bp)；β-actin(正向：5'-CGC CAA CCG CGA GAA GAT-3'；反向：5'-CGT CAC CGG AGT CCA TCA-3'；预 期 产 物 168 bp)。计算达到荧光强度阈值所需的扩增步骤数量(Ct)，ΔΔCt法计算相对表达水平。

7 蛋白提取、蛋白质印迹分析和检测MDSCs中GSK-3β、β-catenin蛋白的表达水平 MDSCs于裂解缓冲液中裂解。BCA蛋白分析试剂盒检测蛋白质浓度。等量蛋白质(50 μg)进行凝胶电泳(SDS-PAGE)，并转至硝酸纤维素膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上。含5%脱脂牛奶的Tris缓冲盐水和0.05% Tween 20 (TBS-T)中室温封闭1 h。随后经适当的抗GSK-3β、β-catenin或内参β-actin一抗4℃孵育过夜。再经辣根过氧化物酶标记的二抗孵育。曝光洗片后凝胶成像分析系统处理。

8 各组细胞免疫组化分析神经分化情况 3组MDSCs经抗NSE抗体和抗NF抗体染色，DAPI复染。典型操作步骤如下，VA处理后4 d，取各组MDSCs于含4%多聚甲醛和0.1% Triton X-100的PBS液中固定15 min。固定后的细胞在4℃下与各一抗孵育12 h，冲洗后与二抗室温避光孵育3 h。PBS冲洗后经DAPI复染。荧光显微镜下观察免疫荧光图像。

结 果

1 MDSCs的光镜图像 传代培养的MDSCs可见较多分裂象，细胞密度明显增加，胞体逐渐舒展，细胞体积增大，细胞形态出现较大变化，可见长梭形的细胞贴壁生长，并出现细胞融合。见图1。

图 1 传代培养的MDSCs(×40)Fig. 1 Sub-cultured MDSCs(×40)

2 不同时间点3组 MDSCs中Wnt/β-catenin信号途径分子表达水平 Real-time PCR：在同一时点，实验组细胞Wnt3a mRNA表达水平最高，抑制剂组其次，对照组最低。3组中两两比较差异均具有统计学意义。同时实验组和抑制剂组诱导4 d后的表达水平高于诱导1 d后，差异有统计学意义。蛋白提取和蛋白质印迹分析：实验组MDSCs经诱导后在相同时点β-catenin表达水平显著高于抑制剂组，抑制剂组β-catenin表达水平高于对照组。实验组和抑制剂组诱导4 d后β-catenin的表达水平高于诱导1 d后，差异均有统计学意义。实验组MDSCs 经诱导后在相同时点GSK-3β表达水平显著低于抑制剂组，抑制剂组GSK-3β表达水平低于对照组。实验组和抑制剂组诱导4 d后 GSK-3β的表达水平低于诱导1 d后，差异均有统计学意义。对照组在1 d和4 d各检测指标结果均无明显差异。见图2。

3 3组MDSCs 的细胞形态 诱导培养4 d后，对照组 MDSCs大多数呈现圆形，实验组和抑制剂组细胞表现出双极或多极形态，在高倍镜观察下更为清楚。与实验组相比，抑制剂组双极或多极细胞比例明显减少。见图3。

4 各组MDSCs的神经细胞特异性标记物表达 对照组未见NSE和NF阳性染色细胞。实验组和抑制剂组NSE和NF免疫细胞化学染色均出现阳性染色细胞。合并后的图像清楚地显示了神经分化的程度。抑制剂组神经细胞特异性标记阳性率明显低于实验组。此外，实验组和抑制剂组MDSCs的NF表达水平高于NSE。见图4。

讨 论

细胞移植疗法为缓解和治愈多种损伤或退行性疾病带来希望，成体干细胞作为细胞疗法的种子细胞在实验中已经取得了良好的治疗效果[16]。作为一种新近发现的成体干细胞，MDSCs在组织工程领域的应用报道日益增多[17]。MDSCs具有自我更新能力，移植后表现出高度的再生能力并展示出较好的细胞生存和多向分化能力[18-20]。

Wnt是一类分泌型糖蛋白，富含L-半胱氨酸，分子量39 ～ 46 kU，通过自分泌或旁分泌发挥作用，目前在哺乳动物中发现了19种Wnt蛋白[21-22]。Wnt蛋白与膜相关受体Frizzled及联合受体LRP5/6结合后活化Wnt/β-catenin信号途径。Wnt/β-catenin信号途径的激活能够抑制GSK-3β的激酶活性，进而阻止β-catenin的降解。β-catenin在细胞质中积累，并进入细胞核，与T细胞因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)相互作用，调节靶基因的表达[23-24]。

相关实验已经证实，MDSCs经过针对性的诱导可以分化为具有类神经表型的细胞[13,25]。本实验旨在研究MDSCs神经分化过程中Wnt/β-catenin信号途径相关分子水平的变化，以明确Wnt/β-catenin信号途径是否参与MDSCs的神经分化过程。诱导1 d后MDSCs即出现双极或多极形态，同时免疫细胞化学染色可见NF和NSE阳性染色细胞，至4 d后表现更加明显。说明采用VA诱导MDSCs向神经细胞分化取得了预期的结果，同时VA并没有对MDSCs产生可观察到的细胞毒性作用，可见实验所采用的诱导方法具有有效性和可行性。实验组MDSCs中Wnt3a mRNA和β-catenin的表达均伴随细胞分化过程而逐渐增加，而GSK-3β表达水平与前二者截然相反，说明在MDSCs的诱导分化过程中，Wnt/β-catenin信号途径被激活。抑制剂组与实验组相比，MDSCs分化过程中Wnt3a mRNA和β-catenin的表达水平有所下降，GSK-3β表达水平上升，证实Wnt/β-catenin信号途径受到了抑制，结合抑制剂组MDSCs分化水平的下降，说明Wnt/β-catenin信号途径的抑制导致MDSCs的神经分化受到抑制。

实验结果证实，Wnt/β-catenin信号途径参与了MDSCs向神经细胞分化的过程，其对MDSCs的神经分化过程至关重要。Wnt/β-catenin信号途径抑制剂的加入并没有完全阻止细胞的分化，说明细胞分化调控是一个复杂的过程，涉及到众多调节通路。至于Wnt/β-catenin信号途径对MDSCs分化过程中的基因水平调控还有待于进一步的研究。

图 2 不同时间点3组MDSCs中Wnt/β-catenin 信号途径分子表达水平A： 对照组培养1 d； B： 实验组培养1 d； C： 抑制剂组培养1 d；D： 对照组培养4 d； E： 实验组培养4 d； F： 抑制剂组培养4 d。所有数据采用±s表示。 aP＜0.05， 与对照组相比； bP＜0.05，与抑制剂组相比； cP＜0.05， 与同组培养1 d相比Fig. 2 Expression level of Wnt/β-catenin signaling pathway in MDSCs at different time points A: control group 1 day; B: experimental group 1 day; C: inhibitor group 1 day; D: control group 4 day; E: experimental group 4 day; F: inhibitor group 4 day. All values are expressed as ±s. aP＜0.05, vs control group; bP＜0.05, vs inhibitor group; cP＜0.05, vs 1 d

图 3 3组细胞诱导4 d后倒置相差显微镜图像 A： 对照组；B： 实验组； C： 抑制剂组(×100)Fig. 3 Inverted phase contrast microscopy showing MDSCs in control group (A), experimental group (B) and inhibitor group (C) 4 days after induction (×100)

图 4 3组细胞诱导培养4 d后的NSE和NF免疫染色及DAPI复染图像(×400) A： 对照组； B： 实验组； C： 抑制剂组Fig. 4 Immune staining and DAPI restaining showing MDSCs in control group (A), experimental group (B) and inhibitor group (C) 4 days after induction(×400)

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Wnt/β-catenin signaling pathway promotes differentiation of muscle derived stem cells into neural-like cells

ZHANG De-long1, WANG Wei2, ZHANG Li2, LI Guang1, YU Guang-ming1, JIN Qiu1
1Graduate School, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China;2Department of Orthopedics, Jinzhou Central Hospital, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China

WANG Wei. Email: weiwang_ly@yahoo.com.cn

ObjectiveTo study the role of Wnt/β-catenin signaling pathway in regulating the differentiation of muscle derived stem cells (MDSC).MethodsMDSC cultured in vitro served as a control group, MDSC induced by valproic acid (VA) to differentiate into neural-like cells served as an experimental group, and MDSC induced by VA and DKK-1 served as an inhibitor group in this study. The Wnt/β-catenin signaling pathway was inhibited with sFRP. The differentiation of MDSC was detected with immunocytochemistry staining. The expression of Wnt3a mRNA, GSK-3β and β-catenin in MDSC was detected by RT-PCR and Western blot, respectively.ResultsThe VA-induced MDSC differentiated into neural-like cells in experimental group and inhibitor group. The differentiation rate was significantly lower in inhibitor group than in experimental group. No MDSC were differentiated in control group. The expression level of Wnt3a mRNA and β-catenin was significantly higher in experimental group and inhibitor group than in control group and in experimental group than in inhibitor group. The expression level of GSK-3β was significantly lower in experimental group and inhibitor group than in control group.ConclusionThe Wnt/β-catenin signaling pathway is activated when MDSC are differentiated into neural-like cells, and blocking the Wnt/β-catenin signaling pathway can thus inhibit the differentiation of MDSC into neural-like cells.

Wnt/β-catenin signaling pathway; muscle-derived stem cells; neural differentiation

R 33-34

A

2095-5227(2014)04-0383-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.04.023

时间：2014-02-19 16:12 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140219.1612.003.html

2013-10-12

张德龙，男，硕士。研究方向：医学组织工程。Email:zhangdelong061130@163.com

王伟，男，博士后，主任医师，教授。Email: weiwang_ly@yahoo.com.cn

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