抗表皮生长因子受体单抗联合X线照射对人鼻咽癌细胞株CNE-2的作用

陈 静，蓝玉玲，杨永强，刘宗文，曲宝林，李建雄，孟玲玲，冯林春,解放军总医院 放射治疗科，北京 0085；郑州大学第二附属医院 肿瘤X线照射科，河南郑州 45004 解放军总医院海南分院 放射治疗科，海南三亚 570

抗表皮生长因子受体单抗联合X线照射对人鼻咽癌细胞株CNE-2的作用

陈 静1，蓝玉玲1，杨永强1，刘宗文2，曲宝林1，李建雄1，孟玲玲1，冯林春1,3
1解放军总医院 放射治疗科，北京 100853；2郑州大学第二附属医院 肿瘤X线照射科，河南郑州 4500143解放军总医院海南分院 放射治疗科，海南三亚 572013

目的观察抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)尼妥珠单抗(h-R3)、西妥昔单抗(C225)分别联合X线照射对人鼻咽癌细胞株CNE-2的作用。方法采用流式细胞仪测定CNE-2细胞表面EGFR表达情况；采用PCRDNA测序技术筛选K-ras野生型CNE-2细胞；采用MTS法检测细胞增殖情况；采用克隆形成实验拟合细胞存活曲线；通过流式细胞仪分析细胞周期分布及细胞凋亡变化。结果在调节CNE-2细胞克隆存活及凋亡方面，C225联合X线照射组的作用优于h-R3联合X线照射组(P＜0.05)；在细胞增殖及细胞周期方面，h-R3联合X线照射组与C225联合X线照射组之间差异无明显统计学意义(P＞0.05)。结论h-R3与C225均能提高X线照射对CNE-2细胞的抗肿瘤作用，C225对该细胞株杀伤作用略优于h-R3。

表皮生长因子受体；西妥昔单抗；尼妥珠单抗；鼻咽癌；放射敏感性

鼻咽癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。鼻咽部的解剖结构和鼻咽癌的生物学特性决定了放射治疗是其主要的治疗手段，单纯X线照射5年生存率约为60%。表皮生长因子受体是一种具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体，在人类多种肿瘤组织中过度表达。鼻咽癌表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的阳性表达率为68% ～ 89%，且其表达异常与肿瘤增殖、分化、血管形成、侵袭转移和放化疗抵抗明显相关[1-4]。研究表明尼妥珠单抗(h-R3)及西妥昔单抗(C225)均能增强X线照射的抗肿瘤效应，但目前国内外尚无这两种单抗作用于鼻咽癌的对比研究[5-10]。本实验对比研究了尼妥珠单抗、西妥昔单抗分别联合X线照射对鼻咽癌细胞株CNE-2的影响，以期为临床治疗提供实验依据。

材料和方法

1 细胞和培养 人鼻咽癌CNE-2细胞购自日本JCRB细胞库，常规培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基中(Gibco，美国)，置于37℃含5%CO2恒温培养箱中。实验时采用对数生长期细胞。

2 药物与照射 尼妥珠单抗购自北京百泰生物药业有限公司，西妥昔单抗购自德国Merck公司，4℃保存，使用时用培养基稀释至等效治疗血药浓度50 μg/ml[6,11-12]。采用日立 MBR-1520R-3型 X 射线仪(Hitachi，日本)室温下进行不同剂量照射。

3 EGFR表达检测 收集对数生长期CNE-2细胞，设实验管和对照管，各管加入1 ml含106细胞数的细胞悬液，再加入含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)，混匀，离心，弃上清液后，在实验管中加入稀释过的抗EGFR单克隆抗体，混匀，置冰上避光45 min左右，再加入含2%胎牛血清的PBS，混匀，离心，弃上清液；对照管及实验管均加入稀释过的抗人488抗体，混匀，置冰上避光30 min左右后，加入含2%胎牛血清的PBS，混匀，离心，弃上清液。上流式细胞仪检测前每管加入250 ～ 300 μl含2%胎牛血清的PBS。

4 K-ras基因突变情况检测 将收集的细胞样本采用PCR-DAN测序技术交予百态生物药业有限公司检测。

5 MTS实验 对数生长期细胞接种于96孔板，每孔加入含有1.0×103CNE-2细胞的悬液100 μl，贴壁过夜。设空白对照组、无药对照组、h-R3组、C225组、单纯X线照射组、h-R3联合X线照射组、C224联合X线照射组。h-R3、C225浓度设定为50 μg/ml，照射剂量为4 Gy。每组设置6个复孔。h-R3组、C225组细胞分别经h-R3、C225处理24 h后继续培养72 h，然后进行MTS(Promega，美国)实验。联合组细胞分别经h-R3、C225处理24 h后照射4 Gy，继续培养72 h后进行MTS实验。将492 nm处测得的光密度值(optical density，OD)按以下公式计算增殖率：

增殖率=(处理组OD值－空白对照组OD值)/(无药对照组OD值－空白对照组OD值)×100%

实验重复3次。

6 平板克隆形成实验 设单纯X线照射组、h-R3联合X线照射组及C225联合X线照射组，将对数生长期CNE-2单细胞悬液适量接种于6孔板中，设置5个照射计量点，分别照射0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy和8 Gy，每个剂量点设3个复孔，贴壁24 h后加入50 μg/ml h-R3或C225，再继续培养24 h后分别给予上述不同剂量X线照射，继续培养72 h后，弃去药液，换常规培养液继续培养10 d后，甲醇固定，0.4%结晶紫(Sigma，美国)染色，低倍镜下计数＞50个细胞的克隆数，计算克隆形成率(plating efficiency，PE)和存活分数(survival fraction，SF)：

克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%

存活分数=联合组PE/单纯X线照射组PE×100%

实验重复3次，将取得的平均数应用Sigmaplot软件，根据单击多靶模型S=1-(1-e-D/D0)N拟合细胞存活曲线，并计算细胞放射敏感性参数即平均致死剂量(mean lethal dose，D0)、准阈剂量(quasithreshold，Dq)、外推值 (extrapolation number，N)及照射2 Gy时的细胞存活分数(SF2)。

7 细胞周期分布及细胞凋亡实验 将对数生长期CNE-2细胞接种于6孔板。设无药对照组、h-R3组、C225组、单纯X线照射组、h-R3联合X线照射组、C225联合X线照射组。每组设3个复孔。贴壁24 h后分别给予h-R3、C225处理24 h后再照射4 Gy，用于细胞周期检测的细胞24 h后收获，用于细胞凋亡检测的细胞48 h后收获。按细胞周期试剂盒和Annexin Ⅴ-FITC凋亡试剂盒(BD，美国)说明书操作，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。实验重复3次。

8 统计学处理 多组间差异采用SPSS13.0统计软件行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 鼻咽癌CNE-2细胞EGFR表达和K-ras突变情况：流式细胞仪检测结果为鼻咽癌CNE-2细胞EGFR高表达(图1A)，PCR-DNA测序法检测CNE-2细胞K-ras为野生型(图1B)。

2 h-R3及C225联合X线照射对鼻咽癌CNE-2细胞增殖的影响：使用MTS法测定各处理组对鼻咽癌CNE-2细胞的增殖抑制作用。与无药对照组相比，各处理组细胞增殖率均明显降低(F=495.43，P＜0.01)。与单纯X线照射组(XRT)相比，h-R3联合X线照射组(XRT + h-R3)及C225联合X线照射组(XRT + C225)细胞增殖率进一步降低(P＜0.01)。h-R3联合X线照射组与C225联合X线照射组之间细胞增殖率差异无统计学意义(P＞0.05)，见图2。

3 h-R3及C225联合X线照射对鼻咽癌CNE-2细胞放射增敏的影响：采用克隆形成实验检测h-R3及C225联合X线照射对鼻咽癌CNE-2细胞的放射增敏的影响。根据克隆形成实验，h-R3、C225对鼻咽癌CNE-2细胞作用后的平均存活分数，拟合生存曲线(图3)，并计算各组细胞放射敏感性参数(表1)。结果显示h-R3及C225对CNE-2细胞均有放射增敏作用，其D0、Dq、N和SF2与单纯照射组相比均明显降低。同时，C225对CNE-2细胞的放射增敏作用较h-R3略强。

图 1 鼻咽癌CNE-2细胞EGFR表达(A)和K-ras突变情况(B)Fig. 1 Expression of surface EGFR (A) and K-ras mutation (B) in CNE-2 cells

图 2 h-R3及C225联合X线照射对CNE-2细胞增殖的影响Fig. 2 Effect of h-R3 and C225 in combination with X-ray irradiation on proliferation of CNE-2 cellsaP＜0.01, vs control; bP＜0.01, vs irradiation alone (XRT)

图 3 h-R3及C225对 CNE-2细胞放射增敏的影响Fig. 3 Effect of h-R3 and C225 on radiosensitivity of CNE-2 cells

图 4 h-R3及C225联合X线照射对CNE-2细胞凋亡的影响Fig. 4 Effect of h-R3 and C225 in combination with X-ray irradiation on apoptosis of CNE-2 cellsaP＜0.01, vs control; bP＜0.01, vs irradiation alone; eP＜0.01, vs irradiation plus C225 (XRT+C225)

4 h-R3及C225联合X线照射射对鼻咽癌CNE-2细胞周期分布的影响 采用流式细胞仪检测细胞周期分布变化情况。与无药对照组比较，h-R3组、C225组、h-R3联合X线照射组及C225联合X线照射组G0/G1期细胞比例均明显增加(F=8.65， P＜0.01)，单纯X线照射组G0/G1期细胞比例变化不大(P＞0.05)；单纯X线照射组G2/M细胞比例增加(F=17.73， P＜0.05)，h-R3联合X线照射组及C225联合X线照射组G2/M细胞比例明显增加(P＜0.01)，h-R3组及C225组G2/M细胞比例变化不大(P＞0.05)；h-R3组、C225组、单纯X线照射组、h-R3联合X线照射组及C225联合X线照射组S期细胞比例均明显减少(F=35.45，P＜0.01)。与单纯X线照射组比较，联合治疗组G0/G1期细胞比例增加(F=8.65， P＜0.05)，G2/M期细胞比例明显增加(F=17.73，P＜0.01)，S期细胞比例明显减少(F=35.45，P＜0.01)。h-R3联合X线照射组与C225联合X线照射组之间细胞周期分布变化差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

5 h-R3及C225联合X线照射对鼻咽癌CNE-2细胞凋亡的影响：采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。与无药对照组的凋亡率(1.13%±0.90%)相比，h-R3、C225、单纯X线照射、h-R3联合X线照射及C225联合X线照射组CNE-2细胞株的凋亡率(分别为6.37%±0.90%、11.13%±1.17%、13.70%±1.80%、18.00%±0.70%及23.7%±2.10%)均明显升高(F=105.15，P＜0.01)。h-R3联合X线照射组及C225联合X线照射组的细胞凋亡率均明显高于单纯X线照射组(P＜0.01)。C225联合X线照射组CNE-2细胞凋亡率高于h-R3联合X线照射组，两者差异有统计学意义(P＜0.01)，见图4。

表1 CNE-2细胞在h-R3及C225联合X线照射作用下的放射敏感性参数Tab. 1 Radiosensitivity of CNE-2 cells after exposure to C225 or h-R3 in combination with X-ray irradiation

表2 h-R3及C225联合X线照射对CNE-2细胞周期分布的影响Tab. 2 Effect of h-R3 and C225 in combination with X-ray irradiation on cell cycle distribution of CNE-2 cells(%)

讨 论

EGFR抑制剂联合放疗的研究表明放疗通过配体依赖或非依赖机制诱导EGFR激活及过表达，导致肿瘤细胞增殖加速，肿瘤细胞DNA损伤修复能力增强和放疗抗拒性产生[13-14]。因此，阻滞放疗诱导的EGFR下游信号通路激活成为增强放疗抗肿瘤作用新的治疗策略。临床研究表明尼妥珠单抗联合放疗与西妥昔单抗联合放疗具有相同的治疗效果，但h-R3的不良反应较C225更轻[6,8,15]。

C225的抗肿瘤作用与EGFR的表达水平及K-ras是否突变有关，而h-R3的抗肿瘤作用与EGFR的表达水平有关，与K-ras是否突变关系不大[7,16-18]。因此，本实验首先检测了鼻咽癌CNE-2细胞EGFR的表达水平和K-ras突变情况。检测结果表明人鼻咽癌CNE-2细胞EGFR高表达且K-ras为野生型。

克隆形成实验能够反映细胞对放疗的敏感性和放疗诱导的亚致死损伤修复能力。抗EGFR单克隆抗体通过降低放疗诱导的细胞内DNA依赖性蛋白激酶的水平，阻断照射后DNA链的修复，从而提高了肿瘤细胞的放射敏感性[17-18]。克隆形成实验结果表明：h-R3联合X线照射组及C225联合X线照射组的SF2、D0、Dq、N与单纯照射组相比均有显著降低，表明h-R3及C225都能提高鼻咽癌CNE-2细胞的放射敏感性及降低放射诱导的亚致死修复能力。在提高细胞的放射敏感性这方面，C225比h-R3更有优势。细胞凋亡检测实验结果显示：h-R3联合X线照射组及C225联合X线照射组细胞凋亡率均明显高于单纯X线照射组(P＜0.05)。同时，C225联合X线照射组CNE-2细胞凋亡率高于h-R3联合X线照射组，两者差异具有统计学意义(P＜0.05)。

在调节细胞克隆存活及细胞凋亡方面，h-R3与C225之间表现出来的差异，可能与两者阻滞X线照射诱导的EGFR下游信号通路激活的能力有关。研究表明EGFR信号通路的激活显著下调细胞凋亡抑制基因bcl-2的表达而上调细胞凋亡活化基因Bax的表达，从而降低了肿瘤细胞的凋亡率和放射敏感性[19]。Garrido等[15]研究发现C225与EGFR的结合力比h-R3与EGFR的结合力高一个数量级。与此同时，C225与EGFR的结合方式和h-R3有所不同。h-R3与EGFR为双价结合，C225为单价、双价同时结合。因此，当EGFR低水平表达时，h-R3与EGFR的结合变得微弱，而C225与EGFR的结合仍会继续。除此以外，Talavera等[20]研究表明h-R3虽阻断了受体与配体的结合，但允许EGFR的活性构象形成，而使基础水平的配体非依赖性通路得以保留。C225没有促使EGFR活性构象的形成，从而更为完全地阻滞了下游信号通路的转导激活。由此可见，h-R3阻滞下游信号通路激活比C225需要更高浓度[21]。

肿瘤细胞所处的周期时相与放射敏感性也有重要关系，其中G2/M期最敏感，G1期次之，S期最不敏感[22]。细胞周期检测结果显示，与单纯X线照射组相比，联合治疗组G0/G1细胞比例增加、G2/M期细胞比例明显增加，S期细胞比例明显减少。可见，抗EGFR单克隆抗体增强CNE-2细胞的放射敏感性，与增加了对放射线敏感的G2/M及G0/G1期细胞，降低了对放射线抗拒的S期细胞有关。在诱导CNE-2细胞周期分布变化方面，h-R3与C225之间差异没有表现出统计学意义。同时，在MTS检测细胞生长增殖实验中，h-R3与C225之间差异也没有表现出统计学意义。一个数学模型实验发现，与高亲和力的C225相比，中等亲和力的抗体如h-R3，高选择性地结合中高表达EGFR的肿瘤组织，而对低表达EGFR的组织细胞结合不稳定，具有较高的肿瘤组织累计率[6]。这也是低剂量的h-R3联合放疗表现出与较高剂量的C225联合放疗类似的治疗效果，而不良反应却较低的临床研究表现的可能机制。

综上所述，本实验研究结果显示h-R3与C225均能提高X线照射对人鼻咽癌CNE-2细胞的抗肿瘤作用，表明综合治疗比单纯X线照射更有优势。在设定的实验条件下，在克隆存活及细胞凋亡方面，C225联合X线照射组调节人鼻咽癌细胞株CNE-2的作用优于h-R3联合X线照射组；在细胞增殖及细胞周期方面，h-R3联合X线照射组与C225联合X线照射组之间差异无统计学意义。h-R3人源化程度高，特异性强，临床研究表明h-R3相关的不良反应较C225轻，患者的耐受性较好，易于接受。因此，目前评判哪个抗体临床应用前景更好为时尚早，有待进一步深入研究。

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Effect of combined anti-EGFR and X-ray irradiation on human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2

CHEN Jing1, LAN Yu-ling1, YANG Yong-qiang1, LIU Zong-wen2, QU Bao-lin1, LI Jian-xiong1, MENG Ling-ling1, FENG Lin-chun1,31Department of Radiation Oncology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Department of Radiation Oncology,Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450014, Henan Province, China;3Department of Radiation Oncology, Chinese PLA General Hospital Hainan Branch, Sanya 572013, Hainan Province, China

FENG Lin-chun. Email: flc301@163.com

ObjectiveTo study the effect of anti-EGFR mAbs, nimotuzumab (h-R3) and cetuximab (C225), in combination with X-ray irradiation on human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2.MethodsExpression of surface EGFR in CNE-2 cells was detected by flow cytometry (FCM). Wild K-ras CNE-2 cells were detected by PCR-DNA sequencing. Proliferation of CNE-2 cells was assayed by MTS. Cell survival curves were plotted by clone formation experiment. Cell-cycle distribution and apoptosis were analyzed by FCM.ResultsThe effect of combined C225 and X-ray irradiation was better than that of combined h-R3 and X-ray irradiation on the survival and apoptosis of CNE-2 cells (P＜0.05). However, no significant difference was observed in their effect on cell cycle distribution and proliferation (P＞0.05).ConclusionBoth h-R3 and C225 can enhance the anti-tumor effect of X-ray irradiation on CNE-2 cells. The effect of C225 is better than that of h-R3 on CNE-2 cells.

epidermal growth factor receptor; cetuximab; nimotuzumab; nasopharyngeal carcinoma; radiosensitivity

R 73-3

A

2095-5227(2014)04-0360-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.04.018

时间：2013-12-17 17:28 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20131217.1728.001.html

2013-10-17

解放军总医院临床科研扶持基金(2012FC-TSYS-1009)

陈静，女，在读硕士。研究方向：鼻咽癌调强放疗。Email:chenjing19861206@163.com

冯林春，男，硕士，副主任医师，硕士生导师。Email:flc301@163.com