PCDH10基因在前列腺癌组织中的甲基化测定及临床意义

刘绍祖，佟 明，张 骞，张 莲，徐 奔，李自智，黄伟超，金艳阳辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州 00；北京大学第一医院，北京 00034

PCDH10基因在前列腺癌组织中的甲基化测定及临床意义

刘绍祖1，佟 明1，张 骞2，张 莲2，徐 奔2，李自智1，黄伟超1，金艳阳1
1辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州 121001；2北京大学第一医院，北京 100034

目的检测PCDH10基因在前列腺癌组织中的甲基化状态，并分析其临床意义。方法应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)技术检测PCDH10基因在3株前列腺癌细胞系、1株前列腺上皮细胞、13例前列腺增生组织和40例前列腺癌组织样本中的甲基化情况，同时分析40例前列腺癌患者的临床资料。结果3株前列腺癌细胞系中有2株检出PCDH10基因甲基化；40例前列腺癌样本中24例(60%)检出PCDH10基因甲基化，13例前列腺增生组织中未检出PCDH10基因甲基化。PCDH10基因出现甲基化患者与未出现甲基化患者相比，在年龄、前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)和临床分期等指标的差异无统计学意义(P＞0.05)，但在Gleason评分的差异存在统计学意义(P＜0.05)。结论PCDH10基因在前列腺癌组织中甲基化程度较高，高Gleason评分的前列腺癌可能具有更高的PCDH10基因甲基化率，提示PCDH10基因甲基化可能与前列腺癌的发生发展有关。

甲基化；PCDH10基因；前列腺癌；甲基化特异性；聚合酶链式反应

前列腺癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率在我国呈上升趋势。在美国，前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为危害男性健康肿瘤的第1位。前列腺癌的具体发病机制不详，待患者出现临床表现而到医院就诊时，往往已发展到中晚期阶段，失去了早期诊断、治疗的机会。目前广泛应用的前列腺特异抗原(prostate- specific antigen，PSA)检测虽然对前列腺癌的诊断有重要价值，但其特异性并不十分理想。DNA甲基化是表观遗传学的主要修饰方式之一，在基因表达的调控、基因结构的稳定等方面有重要作用，与肿瘤的发生发展关系密切[1]。国外研究还发现前列腺癌的恶性程度与DNA甲基化密切相关[2]。因此深入研究甲基化改变与前列腺癌的关系对其诊断有重要意义。PCDH10基因位于4号染色体长臂2区8带上，其异常甲基化已被证实在胃癌、血液系统肿瘤、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、大肠癌的发生发展中均有着重要的意义[3-4]；而在泌尿系统肿瘤的研究中，也发现PCDH10基因的异常甲基化与膀胱癌的发生同样存在密切的关系[5-9]。然而，PCDH10基因在前列腺癌中的甲基化情况尚无相关报道，故本项研究以前列腺癌为研究对象，探讨PCDH10基因在前列腺癌中的甲基化状态，并进一步了解其与前列腺癌患者年龄、前列腺特异性抗原、Gleason评分、临床分期的关系，从而为确定前列腺癌的发病机制和早期生物学诊断提供理论依据。

材料和方法

1 标本来源 收集2012年9月- 2013年5月在辽宁医学院附属第一医院泌尿外科住院并行腹腔镜前列腺癌根治术或经尿道前列腺电切术患者的术后标本，其中前列腺癌组40例，年龄56～88岁，平均72岁，均经B超及病理穿刺活检或病理切片证实。Jewett临床分期：B期6例，C期14例，D期20例。良性前列腺增生组13例，年龄59 ～ 83岁，平均73岁，均经尿道前列腺电切术后病理诊断证实。所有标本均于术后0.5 ～ 1 h取下，并迅速置于液氮盒中，编号登记完毕后置于-80℃冰箱中储存。2 细胞系制备 选取Du145、PC3、Lncap共3株前列腺癌细胞系，以及人类正常前列腺细胞系RWPE-1共1株。细胞系的制备按照常规细胞培养的程序进行，将细胞复苏后置于含有10%胎牛血清、青霉素、链霉素的培养液中，在37℃5%CO2恒温培养箱中培养。

3 组织DNA提取 将样本从-80℃冰箱中取出，将前列腺癌及前列腺增生组织剪成小块，加裂解液混匀。采用TIANGEN公司的DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)，严格按照操作步骤进行组织中DNA的提取，提取后用紫外分光光度仪检查DNA的浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检查完整性。

4 DNA亚硫酸盐修饰 将提取好的DNA样本溶解于30 μl的TE缓冲液中，后加入3.3 μl的NaOH溶液，37℃水浴锅中加热15 min。同时，新鲜配制4.2 mol/L的亚硫酸氢钠溶液，并用3 mol/L的NaOH溶液调节pH至5.0，新鲜配制10 mmol/L的氢醌溶液，同样调节pH为5.0 ～ 5.2；将333 μl亚硫酸盐修饰液加入到DNA样本中溶解、混匀，加3滴矿物油至管顶端，55℃水浴锅中加热4 h，最后5 min将全部样本取出，置于99℃烤箱上烘烤3 min，并轻弹离心管管帽上的液体，使之充分混匀。加热毕，取Qiagen试剂盒中1 000 μl QXI溶液于样本中，再加入40 μl QiaexⅡ溶液于样本中，室温下振荡1 h充分混匀，再依次加入1 ml和500 μl的PE溶液洗涤DNA 2次，再加入50 μl TE缓冲液，充分溶解DNA，室温下放置5 min。向样本中加入5.56 μl的3 mol/L NaOH溶液，再次置入37℃水浴锅中加热15 min，之后加入27.78 μl的9 mol/L NH4OAc溶液，并用50 μl的3 mol/L NaOH溶液矫正pH＜7.0。加入1 000 μl QXI溶液，室温下振荡混匀20 min，再加入500 μl PE溶液洗涤DNA 2次，最后将亚硫酸盐修饰后的DNA溶解于50 μl TE缓冲液中，室温下放置5 min后，统一储存在-20℃冰箱中备用。

5 甲基化特异性PCR 以亚硫酸盐修饰后的DNA作为模板，借助Primer5.0软件设计甲基化和非甲基化特异性引物，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具体引物序列及反应条件见表1。之后在前列腺癌细胞系和前列腺癌样本中分别行热启动PCR扩增，以ddH2O作为空白对照。反应体系 12.5 μl如下 ：5×buffer 2 μl、MgCl21 μl、dNTP 1μl、5'引 物 0.75 μl、3'引 物 0.75 μl、Taq-Gold 酶 0.093 75 μl、模板 0.5 μl、补去离子水6.406 25 μl。扩增后取10 μl MSP扩增产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭溶液中染色。紫外灯下观察结果并截取图片。

表1 MSP中PCDH10基因的引物及退火条件Tab. 1 Sequences of primers and annealing conditions in PCDH10 gene for methylation-speci fi c PCR

结 果

1 PCDH10基因在细胞系中的MSP 1株正常前列腺上皮细胞系未出现PCDH10基因的甲基化，3株前列腺癌细胞系中2株出现PCDH10基因的甲基化，见图1。

2 PCDH10基因在前列腺癌组织样本中的MSP 40例手术切除的前列腺癌样本中24例(60%)出现PCDH10基因甲基化(图2)。13例前列腺增生组织中未检测到PCDH10基因甲基化(图3)。二者相比，PCDH10基因甲基化率差异具有统计学意义(χ2=5.404，P=0.02)。

图 1 PCDH10基因在细胞系中的MSP结果Fig. 1 Methylation-speci fi c PCR showing PCDH10 gene in different cell lines

图 2 PCDH10基因在40例前列腺癌组织样本中的MSP结果Fig. 2 Methylation-speci fi c PCR showing PCDH10 gene in 40 PCa tissue samples

图 3 PCDH10基因在13例前列腺组织样本中的MSP结果Fig. 3 Methylation-specific PCR showing PCDH10 gene in 13 prostate tissue samples

3 PCDH10基因甲基化与临床病理因素的关系进一步分析24例PCDH10基因出现甲基化的患者临床资料，并与余下16例PCDH10基因未出现甲基化的患者资料进行对比，发现两组患者的Gleason评分差异有统计学意义(χ2=75.998，P＜0.05)，而在不同年龄、前列腺特异性抗原(PSA)和临床分期之间差异无统计学意义(χ2=0.111、0.372和1.975，P均＞0.05)。见表2。

表2 PCDH10基因甲基化与前列腺癌临床病理间的关系Tab. 2 Relation between methylation of PCDH10 gene and clinicopathology of prostate cancer

讨 论

众多的研究已表明，DNA甲基化在肿瘤的发生发展中占有重要的地位，其中抑癌基因启动子CpG岛的高度甲基化被认为是肿瘤细胞发生过程中较基因内突变和染色体丢失的更早期事件[10]。而在前列腺癌的发生发展过程中，也存在众多具有明显甲基化倾向的抑癌基因，但目前已经报道的与前列腺癌表观遗传学改变相关的基因，如 GDF15、MC5R、KIAA0182、LOC100130872、ALDH1A3、CLDN8、SPON2等甲基化水平均不理想。因此，研究相关基因在前列腺癌中的表达和甲基化情况，对于进一步认识前列腺癌的发病机制十分重要，也有助于发现新型的早期诊断指标。

PCDH10基因(OL-PCDH、KIAA1400)是原钙黏素基因家族中的成员，由5个外显子组成，长约42.26 kb。原钙黏素是一种介导细胞黏附的细胞受体，而细胞黏附作用已被证实在多种肿瘤的发生和发展中起着重要的作用[11]。这个家族最早于2000年由Wu和Maniatis[12]首先报道，研究发现，该家族参与了细胞生命中各种重要角色，包括细胞分化、识别、排斥和诱导细胞间黏附等。随后由Wolverton和Lalande[13]详细报道了该家族中PCDH10基因的作用，认为其主要在中枢神经系统中发挥作用。后续的研究进一步发现，PCDH10基因是一个在所有成年人正常组织中均可广泛表达的抑癌基因，而体内和体外试验也已证实PCDH10基因可以直接影响肿瘤的生成和侵袭。但对于PCDH10基因如何抑制肿瘤细胞生长的机制尚不明确，一些学者认为，位于PCDH10基因启动子5'侧一个长度约462 bp片段的区域具有高密度的CpG岛，CpG岛发生DNA甲基化可能导致抑癌作用的失活，而Sp1/Sp3和CBF/NF-Y转录因子也可能在其中发挥着关键的作用[14]。此外，PCDH10基因的沉默通过减弱机体对癌细胞迁移的抑制作用，也可能参与了癌症的发生与发展[15]。与此同时，与PCDH10同属黏附蛋白家族TSG区域的一些基因如CDH1、CDH4、CDH13、FAT等也在实体肿瘤中存在高度的甲基化，其中CDH13基因甲基化已证实与前列腺癌发生发展密切相关[16-18]。因此上述TSG区域的基因很有可能共同参与了PCDH10基因甲基化对肿瘤生物学行为的影响。

本研究结果显示PCDH10基因无论在前列腺癌细胞系还是前列腺组织样本中均表现出了较高的甲基化程度，PCDH10基因在前列腺癌中Gleason评分8 ～ 10分组的甲基化率明显高于4 ～7分组，由此可推测，该基因甲基化在前列腺癌发生发展中起着潜在的作用，提示病理分期越高的前列腺癌患者，更容易发生PCDH10基因甲基化。近期Qu等[6]报道，PCDH10基因在胃癌中更倾向在早期的肿瘤中发生甲基化，而且具有甲基化的患者常常预后更差。由于我们缺乏对上述患者的长期随访资料，因此PCDH10基因甲基化对前列腺癌患者预后的影响尚不清楚。

Matsuda等发现，低密度的CpG岛甲基化只能使基因转录受到抑制，只有当基因的CpG岛甲基化达到一定比例(＞60%)时，才足以完全关闭基因的转录表达[19]。我们的研究结果表明，该基因在前列腺癌和良性前列腺增生中的甲基化率分别为60.0%和0，两组间差异具有统计学意义。其甲基化率在不同年龄、前列腺特异性抗原和不同临床分期之间差异无统计学意义。事实上，在其他实体肿瘤的研究中也发现，PCDH10基因可以在癌旁组织中出现甲基化，这提示该基因可能在肿瘤早期即发生了变化，具有强烈的提示意义，但在完全正常的组织中目前尚未有该基因出现异常甲基化的报道，提示PCDH10基因在诊断恶性肿瘤方面具有较强的特异性。因此有理由认为：前列腺组织中若检出PCDH10基因甲基化，则需考虑存在前列腺癌的可能，为前列腺癌的诊断提供一定的参考价值。

本实验样本数不足，缺少随访的相关信息，使得我们很难得出PCDH10基因甲基化与患者生存率的关联信息，上述内容将在我们后续的实验中加以完善，从而更好地判断PCDH10基因甲基化对前列腺癌细胞生物学行为的影响。此外，已有学者在血、尿样本中检测RASSF1A、Tim-3、CDH1等基因的甲基化情况[20-21]。我们也将进一步尝试在血、尿等样本中检测PCDH10基因的甲基化情况，争取为前列腺癌的早期诊断提供新的分子靶标。

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Methylation of PCDH10 gene in prostate cancer tissue and its clinical signi fi cance

LIU Shao-zu1, TONG Ming1, ZHANG Qian2, ZHANG Lian2, XU Ben2, LI Zi-zhi1, HUANG Wei-chao1, JIN Yan-yang1
1First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China;2Peking University First Hospital,Beijing 100034, China

TONG Ming. Email: Dongmingmir@163.com; ZHANG Qian. Email: zhangqianbmu@vip.sina.com

ObjectiveTo detect the methylation of PCDH10 gene in prostate cancer (PCa) tissue and analyze its clinical significance.MethodsMethylation of PCDH10 gene was detected in 3 PCa cell lines, 1 prostate epithelial cell line, 13 hyperplasic prostatic tissue samples and 40 PCa tissue samples by methylation-specific PCR. Clinical data about the 40 PCa patients were analyzed.ResultsMethylation of the PCDH10 gene was detected in 2 out of the 3 PCa cell lines and in 24 out of the 40 PCa tissue samples with a detection rate of 67.7% and 60.0%, respectively. However, no methylation of the PCDH10 gene was detected in the 13 hyperplasic prostatic tissue samples. No significant difference was found in the age, prostate specific antigen (PSA), and clinical stage between those with or without methylation of the PCDH10 gene (P＜0.05). The Gleason score was significantly higher in patients with methylation of the PCDH10 gene than in those without methylation of the PCDH10 gene (P＜0.05).ConclusionThe incidence of PCDH10 gene methylation is rather high in PCa patients. The methylation rate of PCDH10 gene is related with the higher Gleason score, suggesting that PCDH10 gene methylation is related with the pathogenesis and progression of PCa.

methylation; PCDH10 gene; prostate cancer; methylation-specific; polymerase chain reaction

R 737.25

A

2095-5227(2014)04-0379-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.04.022

时间：2014-01-21 15:36 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140121.1536.003.html

2013-10-22

刘绍祖，男，硕士，住院医师。研究方向：前列腺癌的治疗及发病机制。Email: 229781855@qq.com

佟明，男，博士，主任医师，教授。Email: Dongmingmir@163.com；张骞，男，博士，主任医师，教授。Email: zhangqianbmu@vip.sina.com