高效液相色谱法测定清热化毒丸中连翘苷的含量

郑 琰 刘淑华

辽宁省朝阳市食品药品检验所，辽宁朝阳 122000

高效液相色谱法测定清热化毒丸中连翘苷的含量

郑 琰 刘淑华

辽宁省朝阳市食品药品检验所，辽宁朝阳 122000

目的 建立高效液相色谱法测定清热化毒丸中连翘苷含量的方法。 方法 采用Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；以乙腈-水（26∶74）为流动相，检测波长为 277 nm，流速为 1.0 ml/min。 结果 连翘苷进样量在0.2124～5.3100 μg（r=0.9994）线性范围内，线性关系良好，平均回收率为 98.46%，RSD=0.86%（n=6）。 结论 该方法准确、重复性好，可用于清热化毒丸的质量控制。

清热化毒丸；连翘苷；高效液相色谱法

清热化毒丸是由连翘、青黛、黄芩、黄连、菊花、犀角粉等16味药炼制而成，收载于原卫生部药品标准·中药成方制剂第二册，具有清火化毒，消肿止痛的作用，主要用于小儿身热烦躁，咽喉肿痛，口舌生疮，皮肤疮疖，口臭，便秘等。原标准中只有薄层色谱法进行定性分析，而文献资料只有对黄连、黄芩之类的质量分析，没有针对连翘苷的定量分析，药理实验表明，连翘苷具有较强的抗病毒、强心、抗肝损伤性等活性，为了有效地控制药品的内在质量，笔者故建立对连翘苷的高效液相色谱测定法（HPLC）[1-4]。

1仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪；Waters2489紫外检测器；Waters Empower色谱工作站。BP 211D电子分析天平（德国赛多利斯公司），9860 A型超声仪（费纳米科技发展有限公司）。

1.2 试药

连翘苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110821-201112）；清热化毒丸（辽宁仙草堂药业股份有限公司，批号：130901，130301，130501）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱 Hypersil C18（4.6 mm×250 mm；5μm）；流动相：乙腈-水（26∶74）；流速：1.0 ml/min；柱温：28℃；波长：277 nm；理论板数：按连翘苷计算≥3000[5-9]。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取连翘苷对照品适量，加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取清热化毒丸，剪碎，精称15.0 g，置锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定重量，密塞，冷浸过夜，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 取除连翘外的其他药材，按所确定的工艺生产阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性实验 取阴性供试品溶液、对照品溶液、供试品溶液各10 μl，依法分别注入液相色谱仪，在连翘苷对照品色谱相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，阴性对照品溶液在此处无干扰，表明其他组分对测定无干扰（图1）。

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液1、5、10、15、20、25 μl注入液相色谱仪，依法测定连翘苷的峰面积。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=39029X+14747，r=0.9994，结果表明，连翘苷对照品进样量在0.2124～5.3100 μg范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 取供试品（批号130901），精密称取15.0 g，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液。精密吸取10 μl，连续进样6次，测定色谱峰面积的RSD为0.38%，结果表明，仪器的精密度良好。

2.5.4 重复性试验 取同一批号（130901）样品6份，分别精密称取15.0 g，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，精密吸取10 μl，分别进样分析，测定连翘苷的含量，结果平均含量为0.1024 mg/g，RSD为1.3%，结果表明，该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12 h 时分别进样 10 μl，分别进样分析，结果连翘苷峰面积的RSD为0.28%，结果表明，供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.3.6 加样回收率试验 取已知含量的同批样品（批号130901，连翘苷含量为 0.1024 mg/g）6 份，每份 7.5 g，精密称定，分别精密加入连翘苷对照品溶液（0.2124 mg/ml）3.5 ml，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，精密吸取10 μl，注入液相色谱仪，测定色谱峰面积，计算平均回收率，结果见表1。

表1 回收率试验测定结果

2.3.7 样品测定 取3批样品，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，进样 10 μl，采用外标法计算样品中连翘苷的含量，结果见表2。

表2 样品中连翘苷的测定结果（n=2）

3 讨论

3.1 流动相选择

流动相选择时曾采用乙腈-0.1%磷酸溶液 （25∶75）与乙腈-水（26∶74）进行比较实验，结果还是采用乙腈-水（26∶74）作为流动相，连翘苷能与其他杂质有较好的分离。

3.2 提取方法的考察

《中国药典》2010年版中采用的提到方法为上柱法，这种方法操作复杂，耗时长，而笔者采用的超声法操作比较简单，消耗的时间相对比较少，而这种方法重现好，样品与杂质也能够得到好的分离。

3.2 超声时间的选择

在 20、30、40 min 进行测定，结果提示，30 min 时连翘苷已基本提取完全，故确定时间为30 min。

综上所述，本文建立了一种专属性强、简单快捷的定量方法，对连翘苷的质量控制有一定的参考作用。

[1]国家药典委员会.中国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：284.

[2]卫生部药品标准·中药成方制剂（第二册）[Z].274.

[3]南京中医药大学.中药大辞典[M].上海：上海科技出版社，2006：1552-1555.

[4]肖培根.新编中药志（第五卷）[M].北京：化学工业出版社，2007：797-802.

[5]史大军，邱海蕴，康红英.HPLC法测定清喉咽颗粒中连翘苷的含量[J].中国药事，2012，26（1）：57-58.

[6]孟和，朱艳红，吴学军.HPLC法测定保和丸中连翘苷的含量[J].中国药事，2013，27（3）：312-314.

[7]黄螺嘉，杨文红，郑剑红.HPLC法测定小儿感冒退热糖浆中连翘苷的含量[J].中草药，2004，35（7）：768.

[8]陆红柳，谭喜莹，赵陆华，等.连翘中连翘苷HPLC测定方法的改进[J].中草药，2007，38（6）：936-937.

[9]韩桂茹，庞国勋.连翘苷检测波长的研究[J].中国药品，2005，6（3）：71-73.

The content of phillyrin of Qingre huadu wan determined by high performance liquid chromatography

ZHENG Yan LIU Shu-hua
Institute for Food and Drug Control of Chaoyang City in Liaoning Province,Chaoyang 122000,China

ObjectiveTo establish the method of high performance liquid chromatography(HPLC)determining the content of phillyrin of Qingre huadu wan.Methods Hypersil C18 （4.6 mm×250 mm,5 μm） chromatographic column was used.The mobile phase cinsisted of acetonitrile-water(26∶74),the detection wavelength was 277 nm and the flow rate of 1.0 ml/min.ResultsPhillyrin sample volume showed good linear relationship in the range of 0.2124-5.3100 μg(r=0.9994);the average recovery rate was 98.46%,RSD=0.86%(n=6).ConclusionThe method is accurate with a good reproducibility,and suitable for quality control of Qingre huadu wan.

Qingre huadu wan;Phillyrin;High performance liquid chromatography

R286.0

A

1674-4721（2014）04（c）-0061-02

2014-03-19 本文编辑：许俊琴）