结肠息肉样早癌患者早期血清炎症因子变化

张 利 吴慧丽 姚俊芳 李琨琨 肖兴国

河南省郑州大学附属郑州中心医院消化一科，河南郑州 450007

大肠癌在我国发病率位居居第3位，其大多具有明确的癌前病变期(如大肠腺瘤样息肉)，且早期无症状或症状不典型，就诊的临床病例多为中晚期，而且其治疗效果和预后均不理想[1]，是全国重点防治的8种癌症之一，进行早期诊断和综合防治[2]是关键。国内有类似相关研究，均是对中晚期结肠癌等相关血液指标研究，结肠早癌的相关研究少[3]。

该研究通过对我院350例结肠息肉样病变患者，电子结肠镜下行粘膜切除（EMR）或剥离（ESD）后病理学检查证实结肠早癌120例，与单纯结肠腺息肉病组230例，正常结肠镜结肠粘膜200例，检测血液中促炎因子、抑炎因子、抑癌基因水平，进行比较分析，为结肠早癌筛查及诊断提供临床指导，同时对结肠腺瘤向结肠早癌的发生机制进行初步分析、探讨。

1 入选标准、材料与方法

1.1 入选标准及分组

入选标准：选取2010年2月—2014年2月郑州大学附属郑州中心医院通过肠镜检测为结肠息肉样病变，大小均以大于或等于1.0 cm，排除结肠淋巴瘤后350例；分组：对照组：为200例查结肠镜结肠粘膜正常患者，男性126例，女性74例，平均年龄（50±6.5）岁；实验①组：电子结肠镜下行息肉切除（EMR）或剥离（ESD）后病理学检查证实230例单纯结肠腺息肉患者,其中男性123例，女性107例，平均年龄（55±5.5）岁；实验②组：电子结肠镜下行息肉切除（EMR）或剥离（ESD）后病理学检查证实结肠早癌120例患者，其中男性68例，女性52例，平均年龄（57±5.5）岁。

1.2 材料

电子结肠镜(Olympus),细胞裂解液，Rb PTEN、PHLPP兔抗人一抗,羊抗兔二抗,5×上样baffer,Ecl试剂盒 （以上试剂盒及抗体购自上海科兴公司），电泳及电转槽等western仪器设备（郑州大学基础实验室）。

1.3 方法

1.3.1 内镜治疗过程 结肠镜下EMR或ESD操作见图1。

图1 一例直肠息肉内镜下粘膜剥离术：①术前镜下观；②NBI染色后；③完整粘膜剥离后；④剥离组织块。

1.3.2 检测指标 三组患者，均检测血清促炎因子 TNF-a、IL-6、COX2水平,抑炎因子IL-10水平，检测组织APC、PTEN、PHLPP蛋白表达量。

1.3.3 蛋白印迹试验 将收集各样品在低温下提取总蛋白,取上清液，制作标准曲线，测定上清液蛋白浓度，样品均以50ng总蛋白计算上样液体量,进行12.5%PAGE凝胶泳,行电泳、电转,使蛋白转膜,将NC膜用封闭液封闭,再加入一抗低温4℃过夜，加入二抗室温孵育,将NC膜置于ECL(增强化学发光试剂)中反应1～3 min,暗室中使X线片曝光,常规方法显影定影,X线片上的条带用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值，以：APC、PTEN、PHLPP/β-actin的比值表示。

1.4 统计学处理

以mean±SD数据处理并用SPSS 13.0分析,两个独立样本资料采用有序多分类资料秩和检验（Wilcoxon），计量资料组与组之间比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清炎症因子结果分析显示

（1）实验①组与对照组IL-6、Cox2，抑炎因子IL-10水平血清浓度比较，无统计学差异，P＞0.05。（2）实验②血清 IL-6、Cox2浓度较实验组①高，分别为（22.45±4.65）、（31.20±3.46）升高至（45.46±5.69）、（56.46±6.68），而明显高于对照组（18.21±3.68）,（24.16±4.02）；血清抑炎因子IL-10则明显下降，由实验①组（33.46±3.89）下降至（16.56±2.68），较对照组（38.46±4.69）下降明显,实验②组血清IL-6、Cox2、IL-10 与对照组、实验①组比较，P=0.0035、P=0.0040、P=0.0340；P=0.0045、P=0.0328、P=0.0409。3）血清 TNF-a 各实验组与对照组均为差异，以及实验组之间比较无差异 (表1)。

表1 实验组与对照组血清TNF-a、IL-6、Cox2水平和抑炎因子IL-10的变化

2.2 Western-blot检测抑癌因子水平表达

其中实验①组组织APC、PTEN、PHLPP蛋白表达水平与对照组比较，均无统计学意义（P＞0.05），实验②与对照组比较，均有统计学意义，其中PHLPP有显著意义（P＜0.01）；实验②组与实验①组比较，均有统计学差异，且PHLPP存在显著差异（P＜0.01）。（见表2）。

表2 Western-blot检测APC、PTEN和PHLPP蛋白的表达

3 讨论

我国大肠癌发病率逐年增高[4-5]，近30年我国大肠癌发病率总体增加了36.7%。而美国等西方国家，大肠癌发病率和死亡率逐步下降，原因是在预防方面如及时去除癌前病变及结肠早癌，并且建立了循证筛查、并推广。大肠肿瘤筛查被列为国家“十一五”疾病防治工作重点课题[6]。现已证实，85%结肠癌均由结肠息肉发展、恶变而形成，在这一演进过程中，患者血清炎症因子或组织抑癌基因浓度有无变化，尚无类似研究。本研究通过对比分析正常人、结肠腺息肉患者及结肠早癌患者血清炎症因子检测水平及组织中抑癌基因表达水平，得出炎症因子在结肠腺息肉向结肠早癌的发生、发展的作用，初步探讨及作用机制，并分析提示结肠早癌敏感抑癌基因，为临床结肠早癌刷查血清敏感性指标提供帮助，并为结肠癌治疗效果评估指标，这是本研究重点及临床意义。

Paiotti AP等[7]证实,COX2在肠道炎症反应发生中，起重要作用,活动性溃疡性结肠炎患者表达明显增强,表达越强，其肠道炎症也越严重。本实验证实，在结肠早癌组促炎因子IL-6、Cox2表达水平明显高于正常结肠组、结肠腺瘤组血清，P<0.05，而结肠腺瘤组与正常结肠组血清分析比较无差异。而抑癌因子IL-10则在结肠早癌组血清检测最低，说明促炎因子IL-6、Cox2及抑炎因子IL-10在结肠腺息肉向结肠癌演变发展中可能起到一定作用，不排除参与结肠腺瘤向早癌的演进。这与临床理论相符，即结肠或息肉粘膜反复炎症就容易癌变，但机制需进一步研究。而TNF-α存在2个结构不同的受体，传导不同的传导信号:1型和2型受体(TNFR1、TNFR2)，前者导致细胞凋亡，后者是一种促炎因子,在本实验中，TNF-α在正常结肠粘膜组、结肠腺瘤组及结肠早癌组血清表达水平均无明显差异，说明TNF-α信号通路存在一种负反馈平衡,一方面，TNF-α作为促炎炎症，可引起结肠腺瘤的发生、演进；另一方面，增强TNF-α诱导不典型增生细胞凋亡[8]。

肠道抑癌基因据报道有：APC、PTEN、PHLPP,这些基因减少及失活被认为是肿瘤发展的分子水平基础，但那个基因在组织检测水平差异最大，或是哪个基因敏感性最高尚无相关研究。本实验检测到,在结肠早癌组织中，以上三种抑癌基因均表达减少，这与理论一致，以上基因低表达与Akt/mTOR通道调控有关[8]：①在85%结肠癌中APC基因缺失或失活，并且该基因的缺陷与结肠癌的遗传易感性直接相关，在散发性大肠癌的发生中APC基因突变也起着重要作用[9]。APC蛋白失表达可能与大肠癌的发生及演进密切相关。②PTEN调控Akt/mTOR通路去磷酸化调控VEGF发挥肿瘤抑制功能[10]，通过磷酸化而失活。③PHLPP参与调控Akt/mTOR通路中Akt的磷酸化及去磷酸化，也是肿瘤生长调节分子位点。总体来说，抑癌基因APC、PTEN、PHLPP在结肠早癌组织较正常结肠组织及结肠腺瘤组织中表达减低，统计分析存在差异，P<0.035、P<0.042。而PHLPP表达水平有显著差异P<0.007，提示PHLPP是结肠早癌组织表达水平在三者中为最敏感指标。为早期结肠癌筛查提供帮助，同时可通过检测以上基因水平评估结肠癌药物治疗疗效性。

本实验能够得到，促炎因子IL-6、Cox2与抑炎因子IL-10，在不同等级结肠粘膜病变血清检测值不同，分析可能共同参与结肠腺息肉向结肠早癌的发生及演进，并能通过对病人血清炎症因子检测提供预警信号；同时结肠组织中抑癌基因APC、PTEN、PHLPP表达水平，在结肠早癌组织中表达显著减少，PHLPP表达更为敏感，为早期结肠癌筛查提供帮助，同时可通过检测以上基因水平评估结肠癌药物治疗疗效性。分析机制可能因Akt/mTOR通道调控调控以上抑癌基因，磷酸化失活失去对肿瘤发生及演进的抑制作用有关。本研究为临床结肠早癌筛查工作及结肠癌发生的分子基础提出了创新思维，并为大肠癌的防治作出指导性意义，同时下一步我们通过应用Akt/mTOR通道抑制剂雷帕霉素前后检测炎症因子及抑癌基因表达水平，评估雷帕霉素在防治结肠癌临床疗效性。

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