免疫磁珠的原理与特性及其在动物源性食品检测中的应用研究

费 枫，黄迅辰

(1.嘉兴职业技术学院，浙江嘉兴314000; 2.中国计量学院生命科学学院)

免疫磁珠(IMB)简称磁珠。免疫磁珠是通过磁场作用特异性分离目的产物的新兴技术，具有操作简便、灵敏度高、耗时少、生物活性强等特点，是近30年发展起来的新型免疫学分离技术，在食品微生物及其毒素、细菌分离、生化及分子遗传学等领域得到广泛应用。常用免疫磁珠是超顺磁性四氧化三铁纳米磁珠，可通过特殊官能团偶联抗原或标记物，结合于靶物质，并在外加磁场作用下达到分离、纯化的目的。

动物源性食品是指可食用动物的肉、乳、蛋及其制品和副产品。动物源性食品污染通常存在于动物饲养，产品加工、运输和储存的各个环节，包括动物饲料中添加剂残留、农药残留、动物体本身的激素和病原微生物等，经常受到加工、运输过程中的卫生情况和保鲜技术的影响。

对于动物源性食品中的污染物检测技术通常包括色谱法、质谱法、酶联免疫检测法及微生物抑制法等，这些方法大都需要复杂的前处理操作，耗费较长的检测时间，免疫磁珠检测技术则因检测方便、灵敏度高、生物活性强等特点，可以作为动物源性食品污染检测的新技术。

1 免疫磁珠的原理与特性

1.1 免疫磁珠的原理 据Sandeep Kumar V.等(2003)［1］报道，磁性微球材料的自身属性决定磁珠的生物活性和毒性，小于100 nm 的磁珠有较大的比表面积，较高的稳定性和扩散性。磁性微球由磁性元素组成，如铁、钴、镍及其化合物。当磁珠粒径小到临界尺寸时，无磁场下磁化强度为0，达到超顺磁状态，同时对磁场有很高的灵敏度。

磁性微粒可偶联高分子聚合物，进而固定化亲和吸附、离子交换吸附或疏水作用的免疫配基，形成能特异性结合的复合体免疫磁珠。通过免疫磁珠与靶物质(病原微生物，病毒，细菌，化学物质等)相连，在磁场作用下，将其分离，达到快速、灵敏的富集效果。

1.2 免疫磁珠的特性

1.2.1 磁珠粒径 磁性微球粒径均一(10－100 nm)。磁珠粒径越小饱和磁性越小，吸附效率则越大，具有小尺寸效应和表面效应，呈现新的物理性质。磁珠的球型结构有均匀的成核机制，晶体稳定并可减少不同形状粒子间的非特异性结合。

1.2.2 磁珠表面基团 磁性微球表面所含的活性基团可用高分子材料进行修饰以提高应用能力。聚甲基丙烯酸甲脂修饰磁性微球可有效抑制磁珠浓缩而沉淀，修饰的磁珠分散性强，溶解能力是未修饰磁珠的25 倍;油酸修饰可改变免疫磁珠极性，增强其在有机溶液中的溶解性;聚乙烯亚胺修饰可使粒径增大至80 nm，提高磁性微球与免疫配基及其目的捕获物质的结合效率［2］。

1.2.3 磁珠的特异性 免疫磁珠特异性强，其捕获目标物质能力取决于免疫配基的特异性。根据磁性微球高分子材料结合的DNA、RNA、抗体、抗原、生物素等不同特异性配基，可应用于不同分离纯化。多重DNA 探针与免疫磁珠结合，可用于慢性淋巴细胞性白血病和骨髓增生异常综合征等血液系统疾病检测，RNA 固定于免疫磁珠上则可特异性分离细菌，免疫磁珠偶联生物素可提取分离出某些生物毒素。不同浓度样品和不同目标物质决定了免疫磁珠制备时不同的结合顺序，主要取决于免疫配基与目标物质或磁性微球偶联的顺序。

1.2.4 磁珠的适用性 免疫磁珠自组的磁性微球和免疫配基均具有良好的生物活性和稳定性，且在制备偶联过程中对其性质不产生影响。通过分离后得到的目标物质再结合ELISA、PCR 等现代检测技术可有效实现物质的精确分析。免疫磁珠制备所需设备简单，易操作，在应用过程中选择性多，适用范围广;使用后的免疫磁珠经洗涤后可再生，可有效保存数月后仍可重复使用。

2 免疫磁珠的制备方法

2.1 沉淀法 沉淀法是采用二价铁和三价铁碱化沉淀制备出四氧化三铁。Olowe AA.等(1991)［3］研究发现，反应分为3 个步骤:Fe2++ 2OH－→Fe(OH)2;3Fe(OH)2+1/2O2→Fe(OH)2+2FeOOH+H2O;Fe(OH)2+2FeOOH→Fe3O4+2H2O。lida H.等(2007)［4］采用亚铁与乙二胺沉淀或亚铁和三价铁混合与乙二胺沉淀，表征后生成中间产物γ－Fe2O3，后氧化形成Fe3O4，其粒径大于混合沉淀制备的四氧化三铁，且磁性强度更大。Shen YF.等(2009)［5］将亚铁盐和铁盐混合溶于水溶液中，滴加氨水溶液，室温下搅拌1 h，再用聚乙二醇－4000 溶液分散黑色胶状物，氮气保护下90℃水浴锅搅拌30 min，洗涤干燥制备得到平均粒径为12 nm 的纳米四氧化三铁－聚乙二醇微粒，其饱和强度可达到74.3 emu/g，为理论最大值的80%。

2.2 微乳液法 微乳液是由相互不溶的液体形成热力学稳定的分散体系，微乳液较强的分散能力对纳米磁性微球的形成有着重要意义。微乳液表面张力小，增容能力强，形成水包油型(O/W)或油包水型(W/O)微乳液。磁性微球晶体的各向异性直接影响磁珠的超顺磁性和阻塞温度，当微粒达到阻塞温度时，即可表现出特有的宏观磁体特性和纯量子行为，使之成为适用的免疫磁珠。阻塞温度取决于分子间偶极作用，而乳胶粒间的相互作用可改变自由能，因此微乳液法能制备出粒径均一，分散性强的磁性微球。Vidal－Vidal J.等(2006)［6］采用环已胺和油酸作表面活性剂，形成稳定胶状的油胺－纳米磁珠体系，其粒径分布集中，平均为3.5 ±0.6 nm，但表面修饰的油胺容易被油酸所取代，所以生成的磁性微球纯度不高。Yang HH.等(2004)［7］采用反相微乳法制备了SiO2－Fe3O4纳米磁珠，用于酶的固定和免疫检测，球型微粒的平均粒径为53 ±4 nm，表面积为330 m2/g，SiO2形成的孔径为1.427 cm3/g，磁饱和强度达到3.2 emu/g。

2.3 凝胶溶胶法 凝胶溶胶法原理是将Fe2+盐溶液与碱混合形成凝胶网络状态，加入温和氧化剂，通过长时间反应，逐渐形成纳米四氧化三铁，在凝胶网中不聚沉纳米四氧化三铁即为单分散性的磁珠。当纳米四氧化三铁数量增加，凝胶状态部分溶解，可制备得到粒径较大的磁珠。凝胶网网络形成的浓度越大，则纳米四氧化三铁的粒径越小。Ma M.等(2004)［8］采用凝胶溶胶法，以Fe2+盐溶液为变量制备出7.5－416 nm 磁性微球，大于46 nm 的磁珠比吸收率随粒径的减小而增加，而7.5－13 nm 的磁珠具有超顺磁性。

2.4 水热法 水热法是以水为反应介质，将Fe3+盐溶液与还原剂(包括氧化石墨、碱三乙烯四胺、氢氧化钠等)按比例混合，利用高温高压环境使难溶或不溶物质溶解，反应结晶形成纳米四氧化三铁，当反应温度在130℃－250℃之间，随着温度升高可有效提高磁珠磁饱和强度。Fan R.等(2001)［9］将硫化盐铁、硫代硫酸钠、氢氧化钠混合于蒸馏水中，置高温釜内，140℃加热12 h，得到粒径为50 nm 的逆立方尖晶石结构纳米四氧化三铁，产率高达90%。Yan A.等(2008)［10］采用SDS(十二烷基硫酸钠)和PEG(聚乙二醇)混合作为表面活性剂，通过控制反应时间、表面活性剂浓度、FeCl3浓度，制备得到15－190 nm 的磁性微球。

2.5 热分解法 热分解法主要通过金属氧化物和表面活性剂混合，高温加热得到几种金属氧化物的混合物分解产物，这种方法制备的纳米四氧化三铁粒径与表面活性剂、反应温度、铁盐种类有关。Hua GE.等(2003)［11］将Fe2+盐溶于聚乙烯醇，加入氨水使之形成含FeOOH 等的复合物，再用100℃持续干燥12 h，最后用600℃处理得到40 nm 的纳米四氧化三铁磁珠。范娜(2007)［12］采用前驱物(Fe－(CP)2)和草酸钠混合作为前体，600℃持续反应，通过控制(Fe－(CP)2)用量及反应体系(压力、温度等)制备了不同形状和粒径的纳米四氧化三铁。

3 免疫磁珠在动物源性食品病原微生物污染检测中的研究进展

食源性微生物是导致食源性疾病的根本原因，严重影响食品安全，因此建立食源性微生物检测技术有着重要意义。应用免疫磁珠技术可以从食品样品中快速、简便、特异性的分离出目的微生物，配合常规、标准的检测方法，从而实现微生物的快速检测。

3.1 1990年代研究进展 20 世纪90年代，Skjerve E.等(1990)［13］研究了从食品中分离单核细胞增多性李斯特菌，从实验室筛选出李斯特菌，同时分离出菌体鞭毛，用粒径大小为2.8μm 的磁珠和羊抗鼠抗体室温下震荡反应形成免疫磁珠浓度105/μl PBS溶液。结果表明，李斯特菌吸附浓度同磁珠浓度和时间呈正相关，最低浓度约为1 ×102CFU/mL 至2×102CFU/mL。Patel PD.等(1991)［14］制备出磁性微球－生物素－链霉亲和素－多克隆抗体的复合免疫磁珠，可检测出不同食品中沙门氏菌最低浓度为105CFU/g，且将检测时间从5 ～6 d 缩短到1 ～2 d。Olsvik O 等(1994)［15］提出免疫磁珠检测包括细菌(大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏杆菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、肠炎弧菌、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、芽胞杆菌、沙眼衣原体、康氏立克次体等);病毒(肠道病毒、巨细胞病毒、HIV－1、传染性胰腺坏死病毒);寄生虫(恶性疟原虫、曼氏裂体吸虫)。Goodridge L.等(1999)［16］检 测 肉 汤 中 大 肠 杆 菌O157∶H7浓度，首先处理大肠杆菌O157∶H7制备荧光标记噬菌体，通过组装形成磁性微球－荧光标记噬菌体免疫磁珠，离心分离后用流式细胞术检测到大肠杆菌为104CFU/mL，通过改进的荧光过滤法可检测到大肠杆菌的最低浓度为102－103CFU/mL。

3.2 2000年来研究进展 2000年以来，免疫磁珠技术在食源性微生物检测领域取得了更多突破。Mansfield LP.等(2000)［17］用脱脂奶接种沙门氏菌进行培养，用沙门氏菌特异性单克隆抗体M105 偶联磁性微球，固定沙门氏菌。进而用ELISA 方法进行鉴定。相比于一般方法需要72－96 h，而此方法则能在24 h 内完成，且最低检测浓度为105－106CFU/mL。Kumar S.等(2005)［18］用LB 培养基培养伤寒杆菌，用新西兰大白兔免疫获得鞭毛蛋白抗血清，交叉反应获得抗原，用2.8 μm 的磁性微粒，在PBS 中重悬多克隆抗体制备出多抗－免疫磁珠。通过与食品和水样品孵育捕获目的微生物，经PCR 鉴定获得的食源微生物，检测需3－5 d，伤寒杆菌在肉类和牛奶中达106－108CFU/g，蔬菜中达102CFU/g。Jin SQ.等(2009)［19］建立基于免疫磁珠的高通量检测系统，可用于检测金黄色酿脓葡萄球菌、副溶血性弧菌、李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏杆菌、大肠杆菌O157∶H7等。将粒径大小为250 μm 的磁性微粒用异硫氰酸酯表面修饰，偶联用氨基修饰的寡核苷酸，置于聚二甲基硅氧烷的微通道中，再将病原体PCR 产物用泵压入微通道中与免疫磁珠混合。检测过程灵敏度强，特异性高，能在30 min 内完成，且检测浓度按照菌属不同达到500－6000 CFU/mL，可检测包括牛奶、鸡蛋、肉类等动物源性食品。

3.3 近几年研究进展 近年来，免疫磁珠在食源性微生物研究不断升温。Jeníková G.等(2010)［20］用免疫磁珠与沙门氏菌抗体偶联，对浓缩后的菌体样本进行处理，将混合溶液用磁场分离免疫磁珠，用乙醇和蒸馏水洗涤数次除去食品残余和其他微生物，通过PCR 鉴定获得肠杆菌科中有4 种是非沙门氏菌，有17 种是沙门氏菌。同时将免疫磁珠法与普通离心法对比，免疫磁珠法可将食品中沙门氏菌检测时间缩短到24 h 以内，快速完成，且可应用于低浓度和菌体种类复杂的食品样品中。Diler E.等(2011)［21］提出溶菌酶催化中心的突变点影响溶菌酶的催化活性，将其定点突变克隆后，固定在免疫磁珠上，重悬于菌液中，溶菌酶特异性识别细菌细胞壁，将细菌连接在免疫磁珠上，在磁场下将免疫磁珠分离，将细菌洗脱后进一步分析，同时将突变的溶菌酶转录于酵母菌中，表达重组蛋白。这一方法能快速有效的从细胞组织中分离细菌。Wang L.等(2012)［22］用荧光纳米磁珠检测牛肉中的大肠杆菌和沙门氏菌，首先将荧光量子点用三氯甲烷溶解，用甲醇洗涤后干燥，然后用二氢硫辛酸脱氢酶溶液搅拌溶解，离心分离，重悬于PBS 缓冲溶液，用0.2 μm针筒过滤器得荧光量子点水溶液。采用间接法先用EDC 和MES 处理得到QD－EDC－蛋白A 复合物，在此基础上连接抗体DSB－X 生物素。用免疫磁珠处理后作用于牛肉样品磁场分离，可以检测到大肠杆菌和沙门氏菌的最低浓度为10 CFU/g。Krizkova S.等(2013)［23］用锌指蛋白鸡抗修饰免疫磁珠，可高效用于富集金黄色酿脓葡萄球菌及其锌指蛋白，得出捕获效率与抗体浓度、离子浓度、孵育时间呈相关性，然后用SDS－PAGE 鉴定出用免疫磁珠分离的锌指蛋白。

4 免疫磁珠在动物源性食品化学污染物检测中的应用进展

目前，动物源性食品中化学污染问题严重，包括有机物或无机物等化学物质，如食品添加剂，重金属污染，农药残留，水体污染等。免疫磁珠分离法在化学污染物的检测中已得到较好的应用。

4.1 动物源性食品中添加剂检测 盐酸克伦特罗俗称“瘦肉精”，为提高瘦肉率添加于猪饲料中。李超辉等(2013)［24］制备180 nm 纳米磁珠－链霉亲和素－生物素化抗体的免疫磁珠，其中抗体偶联量为77.2 μg/mg，用于捕获猪肉匀浆中的克伦特罗，洗脱后用ELISA 方法检测，免疫磁珠有较大的回收效率。干宁等(2009)［25］用合成的三聚氰胺抗体－纳米磁珠－氯代邻菲哕啉双核铜配合物免疫磁珠固定于丝网印刷电极(SPCE)表面，构建了一种测定牛奶中三聚氰胺含量的安培免疫传感器，能检测的最低浓度为0.25 ng/mL，且检测时间小于20 min。

4.2 动物源食品中毒素检测 肉毒神经毒素具有很强的毒性，比氰化物毒性高1000 亿倍，由厌氧菌产生在食品中残留。Singh BR.等(2000)［26］将抗肉毒神经毒素抗体共价结合于纳米磁珠上，作用于牛奶样品中捕获肉毒神经毒素重链，无需受其酶活性影响，避免其内源性蛋白酶和肽酶的作用，能检测出的最低浓度远低于正常人摄入量70 μg。金黄色酿脓葡萄球菌能产生约50 种具有广泛生物活性的毒力因子，其中有21 种已知肠毒素(SEA)，其生物活性、酶活性、抗原活性类似，能引发人体肠道炎和过敏反应。Rasooly R.等(2012)［27］用葡萄球菌肠毒素抗体偶联免疫磁珠捕获食品中毒素，洗脱后通过细胞中肿瘤坏死因子定量表达检测葡萄球菌肠毒素的生物活性。Pauly D.等(2009)［28］用2.8 mm 的磁珠偶联单克隆抗体和多克隆抗体制备出高通量检测蓖麻毒素、相思豆毒素、肉毒神经毒素、葡萄球菌肠毒素B 的免疫磁珠，将捕获灵敏度从2－546 ng/L 的最低饱和浓度线提高到每500 mL 样品检出浓度为0.3－ 85 ng/L，能检测牛奶、婴儿食品和酸奶等食品。

4.3 动物源性食品中农药残留检测 食品或水体等周围环境中农药残留一直是很受关注的问题，检测方法手段主要包括放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫技术、酶联免疫吸附分析法、生物传感器等。目前免疫磁珠检测农药的研究较少，一般同生物传感器结合进行农药残留检测。莠去津是一种农药除草剂，易被根系吸收，残留在植物体内被畜禽摄入，Byzova NA.等(2010)［29］将30 nm 磁珠偶联抗莠去津单克隆抗体，可以在10 min 内检测出莠去津最低浓度为130 ng/mL。

5 结 语

免疫磁珠检测技术效率比一般方法提高6－8倍，对于动物源性食品检测有着重要意义，可以达到现场检测的目的。

但是，目前免疫磁珠技术还尚未十分成熟，成型商业化的免疫磁珠检测技术、检测试纸、检测卡等甚少，随着更多的检测特异性指标的免疫磁珠开发，免疫磁珠检测将在动物源性食品的安全控制领域，将可能得到更为广泛的应用。

［1］Sandeep Kumar V.Magnetic Nanioarticles－Beased Biomedical and Bioanalytical Applicarions［J］.J Nanomed Nanotechol，2013，4:130.

［2］Wang Z， Guo Y， Li S， et al.Synthesis and characterization of SiO2/(PMMA/Fe3O4 ) magnetic nanocomposites ［J］.Journal of Nanoscience and Nanotechnology，2008，8(4):1797－1802.

［3］Olowe A A，G nin J M R.The mechanism of oxidation of ferrous hydroxide in sulphated aqueous media:Importance of the initial ratio of the reactants［J］.Corrosion science，1991，32(9):965－984.

［4］Lida H，Tajayangi K，Nakanishi T，et al，Synthesis of Fe3O4nanoparticles with various sizes and magnetic properties by controlled hydrolysis［J］.Journal of colloid and interface science，2007，314(1):274－280.

［5］Shen Y F，Tang J，Nie Z H，et al.Tailoring size and structural distortion of Fe3O4nanoparticles for the purification of contaminated water ［J］.Bioresource technology，2009，100(18):4139－4146.

［6］Vidal－Vidal J，Rivas J，Lopez－Quintela M A.Synthesis of monodisperse maghemite nanoparticles by the microemulsion method［J］.Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects，2006，288(1):44－51.

［7］Yang H H，Zhang S Q，Chen X L，et al.Magnetitecontaining spherical silica nanoparticles for biocatalysis and bioseparations［J］.Analytical chemistry，2004，76(5):1316－1321.

［8］Ma M，Wu Y，Zhou J，et al.Size dependence of specific power absorption of Fe3O4particles in AC magnetic field［J］.Journal of Magnetism and Magnetic Materials，2004，268(1):33－39.

［9］Fan R，Chen X H，Gui Z，et al.A new simple hydrothermal preparation of nanocrystalline magnetite Fe3O4［J］.Materials Research Bulletin，2001，36(3):497－502.

［10］Yan A，Liu X，Qiu G，et al.Solvothermal synthesis and characterization of size－controlled Fe3O4nanoparticles［J］.Journal of Alloys and Compounds，2008，458(1):487－491.

［11］Hua G E，Liu Y E，Chen J，et al.Synthesis and ESR of nano—sized ferric oxide supported by PVA［J］.Chem.Res.2003，14(2):9－12.

［12］范娜.前驱物热分解法和液相还原法制备纳米及亚微米级材料［D］.山东大学:无机化学.2007.

［13］Skjerve E，Rørvik L M，Olsvik O.Detection of Listeria monocytogenes in foods by immunomagnetic separation［J］.Applied and environmental microbiology，1990，56(11):3478－3481.

［14］Patel P D，Blackburn C W.Detection of food poisoning agents using immunomagnetic particles［C］Magnetic separation techniques applied to cellular and molecularbiology.Wordsmiths＇ Conference Publications，Somerset，England.1991:93－105.

［15］Olsvik O，Popovic T，Skjerve E，et al.Magnetic separation techniques in diagnostic microbiology［J］.Clinical microbiology reviews，1994，7(1):43－54.

［16］Goodridge L，Chen J，Griffiths M.Development and characterization of a fluorescent－bacteriophage assay for detection of Escherichia coli O157:H7［J］.Applied and environmental microbiology，1999，65(4):1397－1404.

［17］Mansfield L P，Forsythe S J.The detection of Salmonella using a combined immunomagnetic separation and ELISA end－detection procedure ［J］.Letters in applied microbiology，2000，31(4):279－283.

［18］Kumar S，Balakrishna K，Singh G P，et al.Rapid detection of Salmonella typhi in foods by combination of immunomagnetic separation and polymerase chain reaction［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2005，21(5):625－628.

［19］Jin S Q，Yin B C，Ye B C.Multiplexed bead－based mesofluidic system for detection of food－borne pathogenic bacteria［J］.Applied and environmental microbiology，2009，75(21):6647－6654.

［20］Jeníková G，Pazlarov J，Demnerov K.Detection of Salmonella in food samples by the combination of immunomagnetic separation and PCR assay ［J］.International Microbiology，2010，3(4):225－229.

［21］Diler E，Obst U，Schmitz K，et al.A lysozyme and magnetic bead based method of separating intact bacteria［J］.Analytical and bioanalytical chemistry，2011，401(1):253－265.

［22］Wang L，Wu C S，Fan X，et al.Detection of Escherichia coli O157:H7 and Salmonella in ground beef by a beadfree quantum dot－facilitated isolation method ［J］.International Journal of Food Microbiology，2012.

［23］Krizkova S，Jilkova E，et al.Rapid superparamagneticbeads－based automated immunoseparation of Zn－proteins from Staphylococcus aureus with nanogram yield［J］.Electrophoresis，2013，34(2):224－234.

［24］李超辉，熊勇华，郭亮.纳米免疫磁珠富集猪肉中的盐酸克伦特罗［J］.食品科学，2013，14.

［25］干宁，王峰，王鲁雁，等.基于纳米磁珠修饰印刷电极的牛奶中三聚氰胺检测安培免疫传感器［J］.传感技术学报，2009，22(4):456－460.

［26］Singh B R.Intimate details of the most poisonous poison［J］.Nature structural biology，2000，7(8):617.

［27］Rasooly R，Hernlem B.TNF as biomarker for rapid quantification of active Staphylococcus enterotoxin A in food［J］.Sensors，2012，12(5):5978－5985.

［28］Pauly D，Kirchner S，Stoermann B，et al.Simultaneous quantification of five bacterial and plant toxins from complex matrices using a multiplexed fluorescent magnetic suspension assay［J］.Analyst，2009，134(10):2028－2039.

［29］Byzova N A，Zherdev A V，Zvereva E A，et al.Immunochromatographic Assay with photometric detection for rapid determination of the herbicide atrazine and other triazines in foodstuffs ［J］.Journal of AOAC International，2010，93(1):36－43.