糙皮侧耳遗传学研究进展*

徐荣荣，图力古尔

(1.吉林农业大学菌物研究所，吉林 长春 130118； 2.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，农业部农业微生物资源收集与保藏重点实验室，北京 100081)

糙皮侧耳遗传学研究进展*

徐荣荣1，2，图力古尔1**

(1.吉林农业大学菌物研究所，吉林 长春 130118； 2.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，农业部农业微生物资源收集与保藏重点实验室，北京 100081)

糙皮侧耳是我国栽培的主要食用菌之一，从基因组学、数量基因座位、主要农艺性状等方面综述了糙皮侧耳的遗传学研究进展。

基因组；数量基因座位；木质素氧化酶；疏水蛋白

糙皮侧耳是侧耳属的模式种，是世界上广泛栽培的食用菌之一。糙皮侧耳俗称平菇，据中国食用菌协会统计数字，我国平菇大面积的栽培历史始于上世纪70年代[1]，在2012年以前平菇基本上是中国栽培量最大的食用菌，平菇产量占全国食用菌总产量的14，平菇肉质肥嫩，营养丰富，富含蛋白质、膳食纤维、矿物质等多种营养成分，研究表明其胞内组分和次级代谢物如多糖、糖蛋白、血凝素、纤维、萜类化合物、类固醇、核酸等能够降低血脂和血糖水平[2]，具有抗肿瘤、抗凝血、抗病毒、抗衰老、抗组织胺、抗氧化活性[3]，能够降解胆固醇，调节免疫等多种功效[4]，是具开发前景的药用真菌，在食品和医药等领域具有广阔的发展前景。因此，明确糙皮侧耳的遗传学背景，具有非常重要的意义。本文从基因组水平、数量性状定位、酶学水平3个方面论述糙皮侧耳的遗传学研究进展。

1 基因组学研究进展

1.1 染色体基因组

1.2 线粒体基因组

线粒体是真核细胞的1种重要细胞器，它在细胞代谢和生理过程中发挥着重要作用。线粒体基因组从它形成开始就伴随着核基因组DNA共同进化。NCBI网站已公布73种真菌线粒体基因组全序列。糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)线粒体基因组的全序列在GenBank 中登录号为NC_009905。Yong等[6]对糙皮侧耳的线粒体基因组进行了测序和分析，结果表明糙皮侧耳的线粒体DNA为圆形，全长 73 242 bp，GC含量为26.4%，通过BLAST核苷酸序列比对得出整个线粒体基因组中包含了44个基因，他们编码18个蛋白和26个RNA，包括细胞色素氧化酶的3个亚基基因cox1、cox2、cox3，1个细胞色素b基因(cytb)，还原性辅酶Ⅰ的6个亚基基因nad1、nad2、nad3、nad4、nad5、nad6，3个ATP合成酶亚基基因atp6、atp8、atp9。1个核糖体小亚基蛋白基因rps3，1个RNA聚合酶基因rpo，2个DNA聚合酶基因dpo1、dpo2，2个rRNA基因亚基rns和rnl，24个tRNA基因。此外P.ostreatus线粒体还有15个未知功能的开放阅读框。P.ostreatus线粒体基因组是唯一一个已报道的食用真菌线粒体基因组，这一研究成果将为以后食用菌线粒体的研究起到巨大的推动作用。

1.3 端粒基因组

端粒存在于染色体的末端，保证了染色体结构功能的稳定性，由5 bp～8 bp的随机重复序列组成。端粒缩短会导致染色体结构不稳定,引起复制性衰老和凋亡[7]，端粒及其近端结构中含有的物种特异性基因和应激性基因使生物体快速适应不同的生存环境[8]。

Pérez等[9]将糙皮侧耳P.ostreatusN001和2个原生质体菌株PC9、PC15及80个单核子代作为研究对象，定位了11条染色体中的19个端粒。确定端粒大小为 600 bp～1 600 bp，每个端粒中有7个～55个42 bp～330 bp的TTAGGG重复单元。6号和7号染色体端粒的限制性片段和泛素基因 (MV100-1、MV100-2和MV094-3)、漆酶基因(poxC、DyP)相连锁。端粒及其近端结构域存在RecQ解旋酶基因、异核不相容基因和脱氢酶基因。P.ostreatus的6号染色体近端结构的250 kb处存在1个漆酶基因簇，作为特异性基因使糙皮侧耳快速适应新的木质素培养基。

2 糙皮侧耳QTL研究

食用菌中大多数重要农艺性状，如产量、品质、菌丝生长速度等均表现数量性状的遗传特点，即受环境因子和多个数量基因座位(Quantitative Trait Loci, QTL)的共同作用。遗传研究中经常将控制数量性状的多基因作为1个整体，通过数理统计学来剖析和描述QTL的遗传特征。Larraya等[10]利用80个孢子单核体作为作图群体，以178个DNA随机扩增多态性片段、23个RFLP标记、4个疏水蛋白、2个漆酶、2个锰过氧化物酶基因、2种交配型基因座、1个同工酶基因位点为基础，构建了覆盖整个糙皮侧耳基因组的遗传连锁图，共涉及11个染色体，总长 10 007 cM，平均35.1 kbp·cM-1，其物理图谱和遗传图谱中染色体大小的相似性高达76%。随后在该连锁图的基础上，引入5个外源的测交单核体，与作图群体配对获得5个测交双核体群体，通过测定单核菌丝在SEM(Solid Eger Medium)培养基和稻草培养基上的生长速度，共检测到分布于第1号、第2号、第4号、第6号、第7号、第8号、第11号等7个染色体中的12个QTL，解释了双核菌丝生长速度6.26%～25.90%的变异。共有5个QTL与单核菌丝生长速度相关；其中与SEM培养基上单核菌丝生长速度相关的2个QTL，分别位于第4号和第8号染色体，共同解释了38.46%的生长速度变异，另外与稻草培养基上的单核菌丝生长速度相关的3个QTL分别位于第4号、第8号、第11号染色体，可以共同解释41.19%的单核体生长速度变异。分别有2个QTL位于第7号和第11号2号染色体中的相同位点，推测这2个QTL位点是相对稳定存在的。此外4个位于第8号，染色体上的独立的QTL与酯酶同工酶家族est1基因存在连锁关系，而携带不同est1等位基因的单核体菌丝生长速度显著不同，表明该基因可能是参与调控菌丝生长速度的候选基因[11]。第11个染色体上的2个与双核菌丝生长速度相关的QTL，与只在营养生长期表达的疏水蛋白编码基因Vmh2紧密连锁，因此Vmh2也可以作为这个QTL的候选基因。

该研究小组[12]利用1个测交群体在基因连锁图内对糙皮侧耳10个产量相关性状，以及4个品质相关性状进行QTL定位，总共鉴定到控制产量性状的18个QTL，解释了5.70%～48.36%产量性状变异。其中1个QTL定位于具有高度多态性的第7号染色体涉及到所有产量相关性状，而且与双核菌丝生长速度相关的2个QTL紧密连锁，然而质量性状10个QTL分散在整个基因组中，对质量性状的变异贡献不大，仅为3.73%～11.14%。随后Park等[13]将82个在菌褶中表达的功能基因添加到遗传图谱中，注解了31.4%的菌褶中表达的基因和71.5%序列及功能未知的蛋白基因，为糙皮侧耳从营养生长和生殖生长的转变过程中基因调节提供研究基础。

这几天盘存下来，丁主任的脸色越来越难看，最后看着这个少了这么多东西的清单，脸上几乎揪得出水来，他脸色凝重地对着大家，其实甲洛洛感觉是只针对他一个人说的：大家回去想想是怎么回事吧，如果明天早上上班前还想不出来，我们就只有报案了。

Santoyo等[14]在之前作图群体的基础上提出了酶活性QTL(Enzyme Activity QTL)概念。将糙皮侧耳菌株N001减数分裂得到的80个单核体作为作图群体，以锰过氧化物酶(Manganese Peroxidases,MnP)、多功能过氧化物酶(Versatile Peroxidases,VP)和酚氧化酶(Phenol oxidases,Pox)的酶活代替基因结构作为数量性状，采用极大似然法以 0.5 cM 为最小单位进行复合区间作图，绘制了木质素氧化酶基因图谱，对比显示这些数量性状与相应的编码基因，其在染色体中的位置并不相同，通用过氧化物酶(VP)的编码基因mnp1和锰过氧化物酶(MnP)的编码基因mnp3位于第4号、第5号和第6号染色体上，而MnP与VP活性QTL定位在第6号和第11号染色体上，酚氧化酶(Pox)活性QTL定位在第4号和第6号染色体上，锰过氧化物酶(MnP)活性QTL定位在第5号染色体上，其他2个微效QTL单独定位在2号染色体上。研究结果表明，第6号染色体上的QTL与锰过氧化物酶基因mnp2的表达有关，第4号染色体上的1个主效QTL，第8号和第10号染色体上的微效QTL与Pox的活性有关，但这些QTL与已知的pox基因家族在基因组中的位置并无连锁关系。随着P.ostreatus全基因组测序工作的展开和完成，应该借助新型分子生物学技术手段，开发和定位出更多的QTL，为食用菌基因资源的开发利用奠定坚实的基础。

3 主要农艺性状遗传学研究

3.1 木质素氧化酶遗传研究

糙皮侧耳生长所需的营养成分来源于培养基中木质纤维素的降解，而木质素是难分离的大分子，木质素分解能力强弱决定着菌株生长状态的好坏，进而影响产量的高低。木质素降解是氧化过程，锰过氧化物酶(MnP)、多功能过氧化物酶(VP)、细胞外酚氧化酶-漆酶(Laccase)是3种主要的木质素氧化酶酶类[15]。

锰过氧化物酶(Mnp)是1种依赖Mn2+的含血红素的过氧化物酶。该酶广泛存在于白腐菌中[16]。Mnp最早在黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)中发现[17]。锰过氧化物酶(MnPs)是最常见的胞外分泌的木质素分解酶，可以将Mn2+氧化成Mn3+，Mn3+再被包括乙醇酸盐、草酸盐等在内的有机酸螯合剂固定，从而使其由活性位点中被释放出来，直接将底物催化氧化成对应的自由基。锰过氧化物酶基因家族共有9个成员，分别为3个通用锰过氧化物酶基因，Mnp2、Mnp4、Mnp5和6个短锰过氧化物酶基因Mnp1、Mnp3、Mnp6、Mnp7、Mnp8和Mnp9。其中Mnp2和Mnp1核苷酸序列相似性为81%，Mnp2和Mnp3核苷酸序列相似性为66%，Mnp1和Mnp3核苷酸序列相似性为69%。Mnp2、Mnp1和Mnp3编码基因在编码区的G+C含量分别为57.9%、68%和63.7%[18]。

多功能过氧化物酶(VP)在侧耳属和烟管菌属被发现。它们与Mn2+离子、对二苯酚、染料有密切的关系，可以使藜芦基醇、藜芦醚和木质素二聚体氧化[19]。多功能过氧化物酶(VP)在pH为5的最适条件下将Mn2+氧化成Mn3+，在pH为3的最适条件下将木质素氧化分解为藜芦醛，并将藜芦基醇和对二甲氧基苯分别氧化为藜芦醛和对苯醌。多功能过氧化物酶(VP)具有2个同工酶VP-LP与VP-PS1。Ruiz-Duenas等[20]利用DNA探针，采用相应引物获得多功能过氧化物酶(VP)的同工酶(VP-LP)的基因。该基因有2个等位基因PL1、PL2，二者核苷酸序列具有99%的相似性，仅在N端存在1个碱基替换。VP-PS1基因与VP-PL基因都含有15个内含子，有74%的序列相似性。VP-PL和VP-PS1转录翻译蛋白的序列相似性为74%。与GenBank中糙皮侧耳锰过氧化物酶(MnP)基因对比显示，VP-PS1与Mnp2具有98%的序列相似性，VP-PS1与Mnp3具有77%的序列相似性。

漆酶(Laccase)也称作多酚氧化酶，属于蓝铜氧化酶类，能将氧气作为电子受体去除酚羟基中的氢自由基。在糙皮侧耳的形态发生、营养、防御、木质素降解过程中都起着重大作用。研究表明糙皮侧耳中具有11个漆酶基因，分别位于6号染色体的端粒的近端区域及第4号、第6号、第7号、第8号、第11号染色体上，其中lacc6有lacc2表达水平最高是漆酶活动的主要来源[21]。Giardina等[22]从糙皮侧耳中分离出漆酶基因pox1及其亚型pox2。pox1基因大小为 2 592 bp，含有19个内含子，在5’上游序列的174 bp和84 bp处分别含有1个CAAT和TATA的共有序列。经克隆分析对比pox2与pox1的cDNA具有84%的序列相似性，pox1和pox2具有了5个氨基酸的替换差异，二者N端序列和胰蛋白酶肽的cDNA序列相同。pox1含有1个特异的HindIII位点，pox2含有1个BamHI位点，PCR验证表明这2个基因并非等位基因，而是独立进化而来的2个同工酶基因。漆酶基因的表达受营养水平、培养条件和环境中诱导物的影响，Palmieri等[23]发现了糙皮侧耳中漆酶基因poxa1b，铜离子的诱导能明显提高poxa1b的转录水平。Pezzella等[21]以铜离子和阿魏酸作为诱导物分析漆酶基因转录情况，结果显示铜离子诱导了lacc9、lacc10和lacc2基因的表达，阿魏酸诱导了lacc9、lacc10和lacc2基因的表达；在分化后期2个诱导物都存在的情况下，lacc6出现超表达现象；lacc9、lacc10在子实体阶段的表达水平下降，lacc12在子实体形成阶段的表达量增加，lacc1、lacc6、lacc7和lacc8的表达量有较小水平的增加。

3.2 疏水蛋白

疏水蛋白对菌丝的生长有很大的促进作用。在糙皮侧耳生长发育过程中能降低培养基的表面张力，促进菌丝扭结，对抗干燥，促进气体交换，辅助基内菌丝脱离水相环境转变为气生菌丝[24]。糙皮侧耳中的疏水蛋白由100个氨基酸组成，含有8个高度保守半胱氨酸残基和1段长约20个氨基酸的信号肽序列[25]，糙皮侧耳疏水蛋白基因内含有1个 333 bp 的开放阅读框，被2个内含子隔断。目前为止在GenBank EMBL等分子生物学数据库中注册了大约70多个疏水蛋白基因。Peas等[26]从处于营养生长的P.ostreatus菌株中获得3个不同的疏水蛋白基因Vmh1、Vmh2和Vmh3，其中Vmh1和Vmh2只在营养阶段表达，Vmh3只在子实体阶段表达，并且Vmh2基因与双核菌丝生长速度相关的2个QTL紧密连锁。在后继的研究中，Peas等[27]在2个不同的糙皮侧耳子实体中发现了2个特异疏水蛋白基因Fbh1和POH1，采用探针和RFLP分析Fbh1和POH1的基因结构，结果表明他们都为单拷贝基因、编码序列大小、启动子区域,前导肽、内含子、外显子的数量和位置都有很高的相似性，核苷酸和氨基酸序列相似值分别为59%和66%。其中POH1具有2个等位基因Fbh1-1与Fbh1-2，其核苷酸序列具有96%的相似性，氨基酸序列具有99%的相似性。Fbh1-1、Fbh1-2与POH1的序列对比显示分别有59%和58%的相似性。

4 展望

糙皮侧耳是我国食用菌主要栽培种，但是遗传研究进展缓慢，随着糙皮侧耳全基因组测序工作的展开和完成，将获得更多的基因组分子结构信息。借助于新型分子生物学技术手段，糙皮侧耳遗传研究将为基因资源的开发利用奠定坚实的基础。

[1]王贺祥.食用菌学[M].北京：中国农业大学出版社，2004.

[2]Khatun K,Mahtab H,Khanam PA,et al.Oyster mushroom reduced blood glucose and cholesterol in diabetic subjects[J].Mymensingh Medical Journal,2007,16(1):94-99.

[3]Vasudewa NS,Abeytunga DTU,Ratnasooriya WD.Antinociceptive activity ofPleurotusostreatus,an edible mushroom,in rats[J].Pharmaceutical Biology,2007,45(7):533-540.

[4]Wasser SP,Weis AL.Therapeutic effects of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms:a modern perspective[J].Critical Reviews in Immunology,1999,19(1):65-96.

[5]Larraya LM,Pérez G,Peas MM,et al.Molecular karyotype of the white rot fungusPleurotusostreatus[J].Applied and Environmental Microbiology,1999,65(8):3413-3417.

[6]Wang Y,Zeng F,Hon CC,et al.The mitochondrial genome of the basidiomycete fungusPleurotusostreatus(oyster mushroom) [J].FEMS microbiology letters,2008,280(1):34-41.

[7]Liu L,DiGirolamo CM,Navarro PAAS,et al.Telomerase deficiency impairs differentiation of mesenchymal stem cells[J].Experimental Cell Research,2004,294(1):1-8.

[8]Barry JD,Ginger ML,Burton P,et al.Why are parasite contingency genes often associated with telomeres?[J].International Journal for Parasitology,2003,33(1):29-45.

[9]Pérez G,Pangilinan J,Pisabarro AG,et al.Telomere organization in the ligninolytic basidiomycetePleurotusostreatus[J].Applied and Environmental Microbiology,2009,75(5):1427-1436.

[10]Larraya LM,Pérez G,Ritter E,et al.Genetic linkage map of the edible basidiomycetePleurotusostreatus[J].Applied and Environmental Microbiology,2000,66(12):5290-5300.

[11]Larraya LM,Idareta E,Arana D,et al.Quantitative trait loci controlling vegetative growth rate in the edible basidiomycetePleurotusostreatus[J].Applied and Environmental Microbiology,2002,68(3):1109-1114.

[12]Larraya LM,Alfonso M,Pisabarro AG,et al.Mapping of genomic regions (quantitative trait loci) controlling production and quality in industrial cultures of the edible basidiomycetePleurotusostreatus[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69(6):3617-3625.

[14]Santoyo F,González AE,Terrón MC,et al.Quantitative linkage mapping of lignin-degrading enzymatic activities inPleurotusostreatus[J].Enzyme and Microbial Technology,2008,43(2):137-143.

[15]Freitag M,Morrel JJ.Changes in selected enzyme activities during growth of pure and mixed cultures of the white-rot decay fungusTrametesversicolorand the potential biocontrol fungusTrichodermaharzianum[J].Canadian Journal of Microbiology,1992,38(4):317-323.

[16]Orth AB,Royse DJ,Tien M.Ubiquity of lignin-degrading peroxidases among various wood-degrading fungi[J].Applied and Environmental Microbiology,1993,59(12):4017-4023.

[17]Hatakka A.Lignin-modifying enzymes from selected white-rot fungi:production and role from in lignin degradation[J].FEMS Microbiology Reviews,1994,13(2):125-135.

[18]Fernández-Fueyo E,Castanera R,Ruiz-Dueas FJ,et al.Ligninolytic peroxidase gene expression byPleurotusostreatus:differential regulation in lignocellulose medium and effect of temperature and pH[J].Fungal Genetics and Biology 2014,1087-1845.

[19]Caramelo L,Martinez,MJ,Martinez AT. A search for ligninolytic peroxidases in the fungus pleurotus eryngii involving alpha-keto-gamma-thiomethylbutyric acid and lignin model dimers[J]Applied and Environmental Microbiology,1999(4):916-922.

[20]Ruiz-Duenas FJ,Camarero S,Perez-Boada M,et al.A new versatile peroxidase fromPleurotusostreatus[J].Biochemical Society Transactions,2001,29(2):116-122.

[21]Pezzella C,Lettera V,Piscitelli A,et al.Transcriptional analysis ofPleurotusostreatuslaccase genes[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2013,97(2):705-717.

[23]Palmieri G,Giardina P,Bianco C,et al.Copper induction of laccase isoenzymes in the ligninolytic fungusPleurotusostreatus[J].Applied and Environmental Microbiology,2000,66(3):920-924.

[24]Wessels JGH,Asgiersdottir SA,Birkenkamp KU,et al.Genetic regulation of emergent growth in Schizophyllum commune[J].Canadian Journal of Botany,1995,73(S1):273-281.

[25]Wessels JGH.Hydrophobins:proteins that change the nature of the fungal surface[J].Advances in Microbial Physiology,1997,38(38):1-45.

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Research Advancement onPleurotusostreatusGenetics

XU Rong-rong1,2, BAU Tolger1

(1.Institute of Mycology, Jilin Agricultural University, ChangchunJilin130118; 2.Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural SciencesKey Laboratory of Microbial Resources, Ministry of Agriculture, Beijing100081)

Pleurotusostreatuswas one of the major cultivated edible fungi in China. The genetic research progress onPleurotusostreatusin the aspects of genomics, QTL and main agronomic traits were described.

Genome; QTL; Lignin oxidase; Hydrophobic protein

注：不同意上述转让声明的著作权人，在收到论文刊用通知5日内书面回复《中国食用菌》编辑部。

*项目来源：国家科技支撑计划课题“食用菌新品种培育及制种关键技术研究”(2013BAD16B02)。

徐荣荣(1987-)，女，在读硕士研究生，主要从事菌物药学研究。E-mail:xurongrong555@163.com

**通信作者： 图力古尔，教授，主要从事大型真菌资源多样性研究及教学。E-mail:junwusuo@126.com

2014-07-25

S646.1

A

1003-8310(2014)05-0006-04