基于链接校正技术检测细胞膜穿透肽介导的寡核苷酸入胞的研究进展

李海涛，周华军，田书梅，张晓磷，赵云云

（1.三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院 放射科，湖北 宜昌443002；2.三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院神经内科，湖北宜昌443002；3.三峡大学第一临床医学院宜昌市中心人民医院手术室，湖北宜昌443002）

基于链接校正技术检测细胞膜穿透肽介导的寡核苷酸入胞的研究进展

李海涛1，周华军2Δ，田书梅3，张晓磷1，赵云云1

（1.三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院 放射科，湖北 宜昌443002；2.三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院神经内科，湖北宜昌443002；3.三峡大学第一临床医学院宜昌市中心人民医院手术室，湖北宜昌443002）

寡核苷酸（oligonucleotides，ONs）是一类大小不超过20个碱基的短链核苷酸，它已用于家族遗传病及癌症的治疗，显示出巨大的应用前景。但寡核苷酸入胞效率低下，严重影响其治疗效果，成为其临床使用的最大障碍。细胞膜穿透肽（cell-penetrating peptides，CPPs）是一种能够以既不影响生物活性分子的活性也不会损伤细胞的方式携带货物入胞的运载工具，是非常理想的ONs运载工具。但CPPs的入胞能力参差不齐，需要具体考量选择何种CPPs作为ONs的载体。目前已有各种定性、定量评估CPPs细胞转导能力的策略，其中最经典的评价手段是荧光分析法。但鉴于其容易出现假阳性结果的现实情况，特别推荐将其与链接校正ONs相结合进行应用，以更准确的分析CPPs-ONs入胞情况。

细胞膜穿透肽；寡核苷酸；CRE系统；链接校正

寡核苷酸（oligonucleotides，ONs）是一类包括DNA或RNA在内的大小不超过20个碱基的短链核苷酸，它能高效地与其互补对链接，常被用作探针确定DNA或RNA的结构，并被广泛地应用于基因芯片、荧光原位杂交等过程中。目前，ONs已用于治疗家族遗传疾病［1-2］及癌症［3-4］。如Zhou L等［5］研究证实，地中海贫血儿父母的β-球蛋白前体mRNA内含子2（intron 2）的654、705、745位点往往会出现剪切突变。因而，可利用RNase H的惰性反义寡核苷酸（RNase H-inactive anti-oligonucleotides）来纠正此类异常剪接位点，保证β-球蛋白的正常表达，达到干预家族遗传病的目的。Krajewska等［6］研究发现，Bcl-x基因在5’端有2个剪切位点，可编码抑制细胞凋亡的Bcl-x长链（Bcl-xL）和促进细胞凋亡的Bcl-x短链（Bcl-xS）2种功能相悖的蛋白。虽然Bcl-xL与Bcl-xS都是维持细胞正常功能的必需蛋白，但Bcl-xL往往又在多种癌症细胞中过表达。因而可通过阻碍编码Bcl-xL的剪切位点，提高Bcl-xL向Bcl-xS的转变率，增强细胞凋亡信号，促进肿瘤细胞的死亡。虽然已经看到ONs具有巨大的应用前景，但其低下的入胞效率严重影响治疗效果，是ONs临床使用的最大障碍。

细胞膜穿透肽（cell-penetrating peptides，CPPs）是一类具有细胞膜穿透能力的富含阳离子的小分子多肽，它能携带多种生物活性物质入胞，包括蛋白质、核酸、纳米颗粒等，既不影响货物分子的生物活性也不会损伤细胞，是一种理想的递送ONs入胞的生物运载工具。但CPPs种类繁多，入胞能力参差不齐，需要对不同CPPs携带ONs入胞效力、对ONs活性的影响等方面进行具体考查以达到优选的目的。迄今为止，多种成熟的评估技术已见报道，其中最经典的评价策略是荧光分析法：首先用荧光素标记多肽分子，然后通过不同的技术手段对CPPs携带货物穿膜的效率进行检测，包括荧光显微镜观察（fluorescence microscope observation），高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），荧光激活细胞分选术（fluorescence activated cell sorting，FACS）及荧光光谱测定法（spectrofluorometry）等。需要特别注意的是，荧光分析法可能会导致假阳性结果，如Richard等［7］研究发现，荧光可来自于结合在细胞膜上或被滞留在胞内小囊泡中的CPPs；El-Andaloussi等［8］使用低浓度荧光标记的CPPs携带ONs进行细胞定位时发现，尽管实验结果显示的是未入胞或入胞不明确，但仍能检测到ONs的胞内生物活性。

综上可知，目前基于荧光素标记CPPs的检测技术虽然能提供关于CPPs-ONs细胞定位的相关信息，但在实验操作中出现的问题却严重影响了实际应用，包括：①不同的荧光基团可影响不同CPPs的细胞内分布［9］；②荧光基团会影响细胞对CPPs-ONs的摄取［10］；③荧光基团可能对CPPs具有一定的毒性［10］；④可能出现假阳性结果［11］等。因此，利用ONs可诱导活细胞底物转化并出现可检测的生物效应这一检测技术，可有效的弥补荧光标记法检测CPPs-ONs细胞定位实验时容易出现假阳性结果的缺陷，常用的手段包括环化重组蛋白酶（cyclization recombinant enzyme，CRE）系统［12］及链接校正法（Kole's splice correction assay）［13］，其中后者还可配合化学试剂对CPPs-ONs复合物的内摄途径进行研究，是一种更具优势的检测手段。本文主要就基于链接校正法对细胞膜穿透肽介导的寡核苷酸入胞的检测手段进行综述。

1 CRE系统

基于CRE系统的检测技术是一种比较理想的用于判断CPPs携带货物能力的研究手段。这是一种国内外广泛应用的位点特异性重组系统，主要包括2个部分：2个loxP（locus of crossing（x）over P1）位点及识别loxP位点的Cre重组酶，因此CRE系统又可被称为Cre-loxP系统。Cre酶是一种不需要辅助因子便能特异性的催化2个loxP位点之间的DNA发生重组的拓扑异构酶。CPPs-Cre重组蛋白被转导到包含loxP-STOP-loxP的细胞中，Cre酶特异性识别2个loxP位点并切除STOP片段从而影响下游基因的表达，因其特异性高、毒性低，具有显著的应用优势。如Wadia等［12］运用CRE系统成功的检测了经典细胞膜穿透肽TAT运送增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）进入小鼠T细胞的情况。Cre-loxP系统虽然特异性非常强，但它首先需要构建原核质粒表达纯化Cre-CPPs融合蛋白，相当费时费力且很难取得足够量的蛋白，使其无法成为筛选新CPPs的“一线”方法。此外，Cre重组酶分子量很大，会影响CPPs本身的性状。

2 链接校正法

早在1998年，Kole等［13］就成功建立了利用链接校正寡核苷酸（splice correction oligonucleotides，SCOs）来评估生物载体递送货物入胞效力的方法，该策略被称为链接校正技术。由于链接校正发生在细胞核内，是一种细胞内检测技术，这种分析手段可给出CPPs-ONs复合体在胞内的分布情况及其是否发生内囊泡逃逸等相关信息，是一种优于荧光分析技术的检测手段［14］。如Shiraishi等［15］在CPP上引入一个类脂结构域（lipid domain）后得到了新的CPP-CatLip，这种CPP可高效地从内囊泡中逃逸出来，显著提高携带的反义PNA的生物活性。此外，对CPPs而言，ONs因为大小适宜，既不会妨碍CPPs的细胞膜穿膜效力也不会影响其自身特性，是非常理想的货物模型，因而可用于检测CPPs携带ONs的入胞效力。其原理是CPPs携带链接校正ONs进入HeLa pLuc 705细胞系，互补性结合异常剪接位点，因链接校正ONs含有异常剪接位点的荧光素酶基因（luciferse gene），剪接完成就会产生功能性荧光素酶，通过检测其表达量来评估CPPs递送ONs入胞的能力［13］。

2.1 利用链接校正法评估CPPs携带ONs入胞效力 多个研究小组实验表明，链接矫正法是一种非常可靠的检测技术，可通过对比不同的CPPs携带链接校正ONs入胞后荧光素酶报告基因的表达量，来评估CPPs作为生物载体的潜力［16-17］。如Lehto等［18］研究发现，硬脂酰（stearyl）改造的细胞膜穿透肽（RxR）（4）［stearyl-（RxR）（4）］携带质粒入胞的能力是未改造的（RxR）（4）的10倍，且毒性更低；stearyl-（RxR）（4）可高效携带2′-O-甲基（2′-O-methyl，2′-OMe）RNA入胞进行链接校正，而stearyl-Arg 9却不能；此外，虽然（RxR）（4）-PMO同stearyl-（RxR）（4）一样，可引导链接校正ONs入胞，但在相同效率下，其浓度是stearyl-（RxR）（4）的10倍。Saleh等［19］研究发现，可利用链接校正法比较（R-Ahx-R）4-肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）复合物的线性形式与非线性形式的入胞能力，结果显示线性（RAhx-R）4-PNA显示出更高的入胞效力。Arukuusk等［20］设计出了新型CPPs，即硬脂酰改造的TP10类似物（stearylated TP10 analogs）NickFects，其可高效携带链接校正ONs进入悬浮细胞，甚至在极难转染的原代细胞中发挥链接校正作用，其转染效率不仅显著高于LipofectamineTM2000且完全没有细胞毒性。Du等［21］研究证实，富含精氨酸的CPP-（RXRRBR）（2）XB可递送反义吗啉代环寡核苷酸（antisense morpholino oligonucleotides，AMOs）入胞，高效校正毛细血管扩张突变（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）基因。Ezzat等［22］证实，新型CPP-PepFect14（PF14）能高效递送链接校正ONs进入杜氏肌肉萎缩症（Duchenne'smuscular dystrophy，DMD）小鼠肌小管发挥相应生理功能。此外，若通过荧光标记ONs，不仅能测量荧光素酶活性，还能同时定量测定细胞裂解液中荧光强度，从而对CPPs-ONs的入胞情况进行更全面的评估［23］。如Rytkönen等［24］利用介孔硅（mesoporou silicon，PSi）与CPP连接形成的纳米载体递送链接校正ONs入胞，共聚焦显微镜及荧光素酶报告基因显示，其可在5 min内将携带的ONs 100%递送入细胞内，且不会影响其生物活性。

2.2 利用链接校正法评估CPPs携带ONs入胞机制 大量研究表明，各种内吞作用抑制剂能选择性地阻断特定的内吞途径，因此可用来评估CPPs的入胞机制［23-25］。迄今为止，CPPs的入胞途径可能包括：①网格蛋白介导的内吞作用（clathrinmediated endocytosis，CME）［26］；②脂筏／小窝介导的内吞作用（lipid raft／caveolae-mediated endocytosis）［27］；③巨胞饮（macropinocytosis）［12］；④它们的组合摄取方式［28］。造成这种差异性的原因可能是不同CPPs的入胞机制不同，此外，CPPs携带的货物的不同及抑制剂处理浓度的差异可能对结果也有一定的影响。

可选取经典的内吞作用抑制剂来特异性鉴定这3种不同的入胞途径［25］：①使用渥曼青霉素（wortmannin）来同时抑制网格蛋白介导的内吞途径和巨胞饮；②利用细胞松弛素（cytochalasin D）抑制巨胞饮；③利用氯丙嗪（chlorpromazine）抑制网格蛋白介导的内吞作用［7］；④氯喹（chloroquine）能够延缓溶酶体途径中内涵体的形成，并且有利于CPPs-ONs从潜在的内含体中逃逸［29］，因此氯喹可评估内含体途径。此外，为了鉴定细胞外结构对CPPs摄取机制的影响，应当使用肝素酶III（heparinase III），或将细胞培养在过量的肝素中来裂解胞外蛋白聚糖，或选用硫酸乙酰肝素（heparan sulfate）缺陷型细胞株。需要注意的是，这些内吞作用抑制剂很少能产生100%的抑制作用或导致CPPs-ONs彻底从内涵体释放，这可能是几种途径共同参与CPPs-ONs入胞的结果。Hassane等［30］研究发现，细胞膜穿透肽PF6携带链接校正ONs入胞的途径是网格蛋白介导的内吞作用。Saleh等［19］研究发现，（R-Ahx-R）4-PNA复合物的线性形式与非线性形式都是能量依赖的入胞方式，主要是网格蛋白介导的内吞作用，偶可见小窝介导的内吞作用。

3 结语

迄今为止，ONs不仅被广泛应用于基因芯片、荧光原位杂交等过程中，还被用于家族遗传疾病及癌症的临床治疗中。虽然ONs拥有巨大应用前景，但其入胞效率的低下严重影响其治疗效果，成为其临床推广使用的最大障碍。CPPs是一种理想的携带ONs入胞的运载工具，但CPPs的入胞能力参差不齐，需要具体考量选择何种CPP作为ONs的生物载体。基于链接校正法对细胞膜穿透肽介导的寡核苷酸入胞进行检测，不仅可弥补经典荧光分析技术的缺陷，还可对CPPs-ONs复合物的内摄途径进行考察，是一种更具优势的检测技术。但需要注意的是，由于链接校正技术需要特殊的细胞系HeLa pLuc 705，且该检测依赖于荧光素酶底物的发光，不是十分经济。未来应当致力于进一步对此技术进行改良，为临床的推广应用奠定基础。

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（编校：吴茜）

Characterization of cellular internalization pathways for cell-penetrating peptides-mediated oligonucleotide delivery based on splice correction assay

LIHai-tao1，ZHOU Hua-jun2Δ，TIAN Shu-mei3，ZHANG Xiao-lin1，ZHAO Yun-yun1

（1.Department of Radiology，The First Clinical Medical College of China Three Gorges University，Yichang Central People's Hospital，Yichang 443002，China；2.Department of Neurology，The First Clinical Medical College of China Three Gorges University，Yichang Central People's Hospital，Yichang 443002，China；3.Operation Room，The First Clinical Medical College of China Three Gorges University，Yichang Central People's Hospital，Yichang 443002，China）

Oligonucleotides（ONs）are a class of short-chain nucleotides with the size of no more than 20，it has been used to treat hereditary diseases and cancerwhich shows a great prospect considering.The inefficient transduction of oligonucleotides seriously affects its therapeutic effect，which becomes the biggest obstacle to its clinicaluse.Cell-penetrating peptides（CPPs）are capable to carry biologicalmolecules into cellswithoutaffecting its biological activity and damaging the cellmembranes，which makes it the ideal carrier of ONs.Since their transmembrane abilities are uneven，which one should be chose to use need consideration.A large number of experiments can be used to detect the penetrating abilities of CPPs into the cells，and fluorescence analysis is themost classic one.Considering ithas the possibility of causing false positive results，it should be combined with splice corrected ONs to auurately analyze the condition of CPPs-ONs into the cell.

cell-penetrating peptides；oligonucleotides；splice correction assay；CRE system

Q241

A

1005－1678（2014）08－0185－04

国家自然科学基金（81202625）；宜昌市自然科学基金（14301－13）

李海涛，男，本科，主治医师，研究方向：影像生物介入治疗，E-mail：yczxyylihaitao＠sina.com；周华军，通信作者，男，博士，主治医师，研究方向：神经疾病生化药物，E-mail：zhouhuajun02＠126.com。