高效阳离子交换色谱法测定盐酸考来维仑片中有机胺杂质的研究

张伟，任连杰Δ，周长明，吕雯，韩春霞

（1.北京市药品检验所，北京100035；2.赛默飞世尔科技（中国）有限公司，北京100007）

高效阳离子交换色谱法测定盐酸考来维仑片中有机胺杂质的研究

张伟1，任连杰1Δ，周长明1，吕雯1，韩春霞2

（1.北京市药品检验所，北京100035；2.赛默飞世尔科技（中国）有限公司，北京100007）

目的建立高效阳离子色谱法测定盐酸考来维仑片中有机胺杂质含量的方法。方法采用高效阳离子交换色谱对盐酸考来维仑片中有机胺杂质进行定量研究，对该方法进行线性范围、检测限的确定以及准确度、精密度验证，并进行初步应用。结果该方法可以在33min内，同时定量测定癸胺（decylamine）、杂质A（aminoquat）、杂质B（aminodihexylquat）和杂质C（decylaminoquat）4种有机胺类杂质。各个杂质在6.32～58.52μg／mL范围内线性关系良好，回归方程的线性相关系数均大于0.9978。盐酸考来维仑片中测定有机胺杂质的回收率为102.9%～114.6%，RSD为1.8%～2.4%（n＝9）。结论该方法简单、快速、准确，可用于盐酸考来维仑片中有机胺杂质的测定。

离子交换色谱；有机胺；盐酸考来维仑

高脂血症是动脉粥样硬化的主要发病因素之一，与心脑血管疾病的发生直接相关，常用血脂调节药主要有他汀类、贝特类、烟酸类、胆酸螯合剂类等，它们调节血脂的效果各有差异，各类药物均存在不同的不良反应［1-3］。作为新型的血脂调节药胆酸螯合剂类药物具有离子交换树脂的作用，主要有考来烯胺（消胆胺）、考来替泊以及最新上市的盐酸考来维仑，具有与胆酸的亲和力更强的特点，因此可以降低使用剂量，从而减少胃肠道的不良反应［4］。

盐酸考来维仑的化学名为1-氯-2，3环氧丙烷，［6-（丙烯胺基）-己基］三甲胺氯化物和N-烯丙基癸胺氯化物的烯丙胺多聚体［5-6］。作为具有亲水性而又不溶于水的聚合物，对其质量控制一直是个难点，特别是相关杂质的控制。相关研究鲜有报道。仅在美国药典征求意见稿中有所涉及，对于盐酸考来维仑的质量控制主要集中在甘氨胆酸盐结合力、氯化物、溴化物、氯甲代氧丙环（表氯醇）、水溶性胺类、烯丙胺、有机溶剂等方面。而对其中可能存在的主要有机胺类相关杂质（包括工艺杂质和降解杂质）的控制更是未见相关文献报道。本文建立了高效阳离子交换色谱法测定盐酸考来维仑片中有机胺相关杂质的新方法，同时对4种有机胺类杂质进行定量分析，试验结果表明，本方法可简便、灵敏、准确的测定相关杂质，为该品种的有机胺类杂质控制提供了研究方案。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 Dinoex BioLC ICS-3000色谱系统（赛默飞世尔公司），包括带有真空脱气单元的GS50的四元梯度泵、AS50色谱柱箱以及配有电导检测器和阳离子抑制器；色谱数据采集和处理采用Chameleon 6.5色谱工作站；AG245电子天平（METTLER TOLEDO梅特勒托利多）。

癸胺（decylamine，美国Sigma公司）、杂质A（aminoquat）、杂质B（aminodihexylquat）、杂质C（decylaminoquat）。杂质对照品（美国International Laboratory公司），盐酸考来维仑片（北京某制药公司，规格为625mg，批号为20130801，20130802，20130803）。

1.2 溶液的配制

1.2.1 稀释液：5mmol／L盐酸溶液（37%盐酸0.45 mL加水至1000mL）-乙腈（7∶3）。

1.2.2 杂质混合对照品储备液：精密称取溴化季铵盐氢溴酸盐（杂质A）对照品10.56 mg、溴化季铵盐氢溴酸盐（杂质B）对照品9.70mg、溴化季铵盐氢溴酸盐（杂质C）对照品9.64mg，置25m L量瓶中；另精密称取癸胺对照品64.10 mg，置10 mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1mL至上述25mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得4种杂质的对照品储备液（浓度分别为杂质A 0.3051mg／mL、癸胺0.3158 mg／mL、杂质B 0.2926mg／mL、杂质C 0.3111mg／m L）。

1.2.3 线性对照品溶液：依次精密量取对照品储备液7.5、5.0、2.5、1.0mL，分别置50mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得杂质A浓度分别为45.76、30.51、15.25、6.10μg／mL，盐酸癸胺浓度分别为47.37、31.58、15.79、6.32μg／mL，氯化季铵盐杂质B盐酸盐浓度分别为43.89、29.26、14.63、5.85μg／mL，氯化季铵盐杂质C盐酸盐浓度分别为46.67、31.11、15.56、6.22 μg／mL的线性对照品溶液L1、L2、L3、L4。

1.2.4 空白辅料溶液：精密称取按盐酸考来维仑片剂处方量混合的空白辅料粉末适量（约相当于盐酸考来维仑200mg），置离心管中，精密加入稀释剂10mL，涡旋30 s，离心5 min，上清液以0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

1.2.5 供试品溶液：取本品10片，称重，计算平均片重，研细，取适量（约相当于盐酸考来维仑200mg），精密称定，置离心管中，精密加入稀释剂10 mL，涡旋30 s，离心5 min，上清液以0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

1.2.6 系统适用性溶液：取1.2.3中L2溶液作为系统适用性溶液1；取1.2.3中L4溶液作为系统适用性溶液2。临用现配。

1.3 色谱条件 色谱柱为羧酸基阳离子交换柱（Dionex IonPac CS17 RFIC 250 mm×4 mm），预柱（Dionex IonPac CG17 RFIC 50mm×4mm）流动相为甲磺酸（50mmol／L）：乙腈：水，梯度洗脱（见表1），流速为1.2mL／min，柱温为40℃，进样体积为100μL，电导检测器，抑制器（Dionex CSRS300，4mm）。进样前用流动相冲洗色谱系统至基线稳定。每天分析结束后，用至少30 mL超纯水冲洗色谱柱至初始状态。

表1 洗脱条件Tab.1 Elution requirement

1.4 方法的验证

1.4.1 系统适应性：精密量取系统适用性溶液1 100μL，注入离子色谱仪，连续进样6次，记录色谱图，考察分离度及进样精密度。另精密量取系统适用性溶液2 100μL，注入离子色谱仪，记录色谱图，考察各杂质峰的信噪比。

1.4.2 专属性考察：精密量取稀释剂、空白辅料溶液、供试品溶液各100μL，注入离子色谱仪，记录色谱图。

1.4.3 线性范围与检测限：将4种有机胺类杂质对照品配制成系列浓度的对照品溶液，分别进样分析，以各个杂质的浓度及相应的峰面积进行线性回归分析。

1.4.4 精密度考察

①重复性：精密称取制剂粉末300 mg，平行制备6份，按1.2.4项下配制方法配制，分别精密量取100μL注入离子色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积分别计算各杂质的含量。

②中间精密度：由不同分析人员在不同天数精密称取制剂粉末各6份，按1.2.4配制方法配制，分别精密量取100μL注入离子色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积分别计算各杂质的含量。

1.4.5 准确度考察：取按本品处方量混合的空白辅料粉末约122mg，精密称定，共9份。分别精密加入一定量的混合对照品储备液，制备成高、中、低3个浓度（分别各杂质限度浓度的50%，100%、150%）的供试品溶液，每个浓度配制3份。分别进样测定，按外标法以峰面积计算各杂质含量。将所得含量与加入的标准量进行比较，计算回收率。

1.4.6 耐用性考察

①溶液的稳定性：取重复性溶液1于室温放置12 h，每隔3 h进样1次，记录色谱图，计算各杂质峰面积的RSD%。

②色谱条件变化：考察其他色谱条件不变的情况下，分别降低色谱柱温度5℃、增加和降低流速0.1mL／min条件下，色谱系统测定结果的稳定性。

1.5 供试品测定 取3批盐酸考来维仑片，按照1.2.4项下制备供试品溶液。精密量取杂质混合对照品储备液适量，加稀释剂定量稀释成每1m L中含杂质A 27.10μg，癸胺28.02μg，杂质B 27.15μg，杂质C 26.89μg的溶液，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液和对照品溶液各100μL，分别注入色谱仪，记录色谱图，以峰面积按外标法计算各杂质含量。

2 结果

2.1 系统适应性 各杂质与相邻色谱峰的分离度均大于1.5（见图2），各杂质峰面积的RSD均低于5%。系统适用性溶液2的检测灵敏度均能达到信噪比大于10（见表2）。

表2 系统适用性测定结果Tab.2 Results of system suitability test

图1 系统适用性溶液1的典型色谱图Fig.1 HPLC chromatography of system suitability

2.2 专属性考察 供试品溶液各杂质分离度均符合要求；稀释剂、空白辅料对各杂质的测定无干扰（见图3）。

图2 专属性考察的液相色谱图Fig.2 HPLC chromatography of specificity study

2.3 线性与检测限除癸胺相关系数为0.9978外，其他各杂质相关系数均大于0.999，说明各杂质的线性相关性良好。当信噪比（S／N）为3时，测定各杂质的检出限均达到0.4μg／m L（见表2）。

表2 4种有机胺杂质的线性范围及检测限Tab.2 Linear ranges and limits of detection of4 impurities

2.4 精密度考察

2.4.1 重复性：测定的平均结果分别为杂质A 0.047%、癸胺0.052%、杂质B 0.009%、杂质C 0.025%，RSD分别为0.9%、2.4%、4.0%、2.6%。

2.4.2 中间精密度24份样品各杂质含量的RSD分别为4.0%、3.1%、4.1%、3.2%。

2.5 准确度考察 各个杂质的回收率分别为杂质A 102.4%、癸胺102.1%、杂质B101.7%、杂质C 100.5%，回收率数据的RSD分别为2.0%、1.3%、3.9%、1.8%。

2.6 耐用性考察 杂质A峰、癸胺峰、杂质B峰、杂质C峰面积RSD分别为6.0%、1.9%、5.4%、6.6%。本方法耐用性良好（见表3）。

表3 耐用性考察结果Tab.3 Results of robustness test

2.7 供试品测定 取3批盐酸考来维仑片，按照1.2.4项下制备供试品溶液，并按照1.4.7项下对供试品进行测定，测定结果见表4，供试品色谱图见图3。

表4 样品中的有机胺杂质含量Tab.4 Contents of organic amine in Colesevelam Hydrochloride tablets

图3 盐酸考来维仑片样品有机胺杂质的HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of organic amine in Colesevelam Hydrochloride tablets

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

3.1.1 流动相的选择

①流动相组成的选择：对于阳离子型化合物的测定，通常通过在流动相中加入甲磺酸来提高化合物的响应。但是，甲磺酸浓度太低，化合物响应低，甲磺酸浓度太高，基线波动值会增高。通过尝试不同浓度的甲磺酸，最终确定50mmol／L的甲磺酸最合适。在仅有水相和甲磺酸相的情况下，杂质B和杂质C出峰太慢，峰形差，且影响工作效率，流动相中加入乙腈后发现，洗脱时间减少，提高了工作效率。随着流动相中乙腈比例的增大，洗脱时间相应减少，故最终确定乙腈比例使用40%，即抑制器的最高耐受值。

②比例的选择：水相、甲磺酸相、乙腈相不同比例下，色谱峰的出峰时间有所不同，分离度不同，为保证各杂质与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，最终确定本实验色谱条件。

3.1.2 柱温的选择：考察了不同柱温下色谱条件的系统适用性，发现随着柱温升高，峰形变锐，分离度增大，柱压降低，故最终确定采用40度柱温，得到良好的色谱峰，且保护柱子。

3.2 目前，有机胺的测定方法主要有荧光法［7］，高效液相色谱法［8］以及离子交换电雾检测法［9］，本试验建立了一种利用阳离子交换色谱法同时测定4种有机胺杂质含量的方法，该方法简便、快速、准确。不仅可以用于盐酸考来维仑原料及制剂的相关杂质控制，也为具有亲水性而又不溶于水的聚合物类型药物中有机胺类杂质的质量控制提供了一种方法。

［1］王谊，吕昊宇，蒋建勤.药物治疗高脂血症的作用机制［J］.西北药学杂志，2014，27（2）：188.

［2］Cleeman JI.Executive summary of the third report of the national cholesterol education program（NCEP）expert panel on detection，evaluation，and treatment of high blood cholesterol in adults（adult treatment panel III）［J］.JAMA，2001，285：2486.

［3］齐丽彤，孙跃民，李树仁，等.苯磺酸氨氯地平／阿托伐他汀钙复合制剂治疗高血压病合并高脂血症的有效性和安全性［J］.中国新药杂志.2013，（18）：2159-2163.

［4］李犁，杜晓红，张建瑞，等.调血脂药物的临床应用现状与研究进展［J］.基层医学论坛，2012，16（25）：3360-62.

［5］USP Pending Monograph.Colesevelam.2012USP.http：／／www.usp. org／usp-nf／pending-monographs.

［6］http：／／www.ema.europa.eu／ema／index.jsp？curl＝search.jsp＆q＝colesevelam＆mid.

［7］彭浩南，刘太宏，何刚，等.基于胆固醇苝酰亚胺衍生物的有机胺荧光传感薄膜.中国化学会第三届胶体和界面化学会议论文摘要集［C］.2011.

［8］Pielesz A，Baranowska I，Rybak A，W lochowicz A.Detection and determination of aromatic amines as products of reductive splitting from selected azo dyes［J］.Ecotox Environ Safe 2002，53（1）：42-47.

［9］叶明立，陈郁.离子交换电雾检测测定CO2吸收液中一乙醇胺、二乙醇胺、N-甲基二乙醇胺［J］.浙江大学学报（理学版），2011，38（4）：433-435，488.

Research of organic am ine impurities in Colesevelam Hydrochloride by high performance cationic exchange chromatogrphy

ZHANGWei1，REN Lian-jie1Δ，ZHOU Chang-ming1，LVWen1，HAN Chun-xia2

（1.Beijing Institute for Drug Control，Beijing 100035，China；2.Thermo Fisher Scientific（China）Co.，Ltd，Beijing 100007，China）

ObjectiveTo set up method for determining impurities content of organic amine in Colesevelam Hydrochloride tablet by using high performance cationic exchange chromatography.MethodsQuantitative research of organic amine impurities in Colesevelam Hydrochloride tablet was detected by using high performance cationic exchange chromatography.To validate the linearity range and limit of detection，as well as accuracy and precision，and tentatively apply this method.ResultsThis method could simultaneously determine four organic amine impurities：decylamine，aminodihexylquat，decylaminoquat and aminoquat in 33min.The linear relation of each impurity was excellentwithin the range of6.32μg／mL～58.52 μg／mL（r＞0.9978），the recovery was between 102.9%～114.6%with RSD between 1.8%～2.4%（n＝9）.Conclusion This method is simple，rapid and accurate to determine impurities content of organic amine in Coleserelam Hydrochloride.

ion exchange chromatography；organic amine；Colesevelam Hydrochloride

R917

A

1005－1678（2014）08－0170－04

张伟，男，硕士，主管药师，研究方向：药物分析，E-mail：maximer325＠sohu.com；任连杰，通信作者，男，硕士，副主任药师，研究方向：药物分析，E-mail：warenlj＠hotmail.com。