生物发光技术在细菌生物被膜感染中的应用

刘旭,李悦,蔡芸△,王瑾,王睿

(1.解放军总医院 临床药理研究室,北京 100853;2.解放军总医院转化医学中心,北京 100853)

生物发光技术在细菌生物被膜感染中的应用

刘旭1,李悦2,蔡芸2△,王瑾2,王睿2

(1.解放军总医院 临床药理研究室,北京 100853;2.解放军总医院转化医学中心,北京 100853)

细菌生物被膜感染难以根除，应用传统方法研究动物生物被膜感染需耗费大量动物且不能动态监测动物体内生物被膜发展情况，生物发光技术解决了这一难点。近年来，生物发光技术逐渐应用于细菌生物被膜感染研究中，展现了良好的发展前景。本文对细菌生物发光技术的机制、特点及近年来生物发光技术在生物被膜感染模型、抗菌药物有效性方面、指征移植材料上生物被膜易感性的应用做一综述。

生物发光技术；细菌生物被膜感染；感染模型；抗菌药有效性；移植材料易感性

细菌生物被膜(bacterial biofilm,BF)是指细菌粘附于物体或人体组织表面,通过分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等,将其自身包绕其中而形成的大量高度组织化、系统化的膜样聚合物［1］。因其特殊结构,BF可以对抗免疫系统和抗菌药物作用,使得感染根除十分困难［2］。生物发光技术具有非放射性、高灵敏度、非侵入性等优点,且能实时动态监测BF在体内的发展情况［3-4］。本文通过查阅相关研究文献,对细菌生物发光机制、生物技术在BF感染的发展及应用作一综述,以期为研究者应用生物发光技术诊断、治疗BF感染提供参考。

1 细菌生物发光机制

生物发光成像检测的光是由特定底物和荧光素酶作用所产生的,建立BF发光有2种方法:第一种是从细菌,如发光冷杆菌等,获取lux操纵子来编码合成荧光素酶和荧光素底物,可将lux操纵子转移到其他种类的细菌上来进行成像研究,细菌lux操纵子的表达特点是不需要外源性底物就能发光［5］。Rochetta等［5］曾通过导入luxCDABE的大肠杆菌来研究生物发光技术用来确定体内外抗菌药物的疗效;Daniel C等［6］也曾将克隆lux操纵子的鲍曼不动杆菌感染小鼠,通过生物发光技术来检测感染范围。

第二种是从有机体,如北美萤火虫等一些发光生物的荧光素酶基因标记细胞或细胞染色体DNA,通过单克隆筛选技术,将荧光素酶的基因插入到预期观察细菌的染色体内,使荧光素酶基因得以持续稳定表达,外源性给予底物荧光素后,荧光素和荧光素酶发生反应,生成氧化荧光素释放光子并发光［4］。早在1985年,Dewet JR等［7］克隆了P.Pyralis的荧光素酶基因,并使其在大肠杆菌中表达。

2 生物发光技术在BF感染应用中的发展

1995年,Contag等［8］首次证明了应用生物发光成像技术监测小鼠体内细菌感染的可行性;2005年,Jun Y等［9］建立了小鼠体内金黄色葡萄球菌BF感染模型,应用生物发光技术成功的监测了对利福平耐药的金黄色葡萄球菌突变株在体内生长的适应性,为研究耐药菌株提供了参考;同年,Cla'udia等［10］使用Sorbarod持续灌注系统培养铜绿假单胞菌PAO1生物被膜,用环丙沙星灌注生物被膜3 h后待其恢复到未加药前的水平时再开始第二次给药灌注,用生物发光技术来追踪环丙沙星对抗铜绿假单胞菌BF感染的效果,这一研究表明生物发光技术可以用来评估抗菌药物对抗 BF感染的有效性;2010年,Bernthal NM等［11］将金黄色葡萄球菌接种到膝关节并植入到小鼠体内,用生物发光成像技术实时监测BF,结果发现:表面涂有米诺环素和利福平的移植膝关节上BF的形成大大降低,这一模型不仅可以用于评估体内治疗BF感染,同时也为关节成形术后感染的预防提供了方法;2013年,Garcez AS等［12］将牙根管灌注铜绿假单胞菌,3 d后待其形成BF后,将其植入10颗人类牙齿中,用生物发光技术连续监测和评估细菌活性,这一实验为治疗牙根管生物被膜感染提供了研究模型;2014年,Vande Velde G等［13］在动物皮下植入感染了白色念珠菌的导尿管,应用生物发光技术实时监测体内白色念珠菌BF的形成,包括从酵母到菌丝的形态变化,这一研究使得人们对与酵母菌感染类似的BF感染的致病机制有了进一步了解。

3 应用

BF是细菌相对于浮游状态的一种群体生存形式,存在于BF中的菌体较其浮游状态对抗菌药物表现出更强的抗药性［14］。为了评估细菌活性、监测BF的形成,治疗BF感染,研究者们不断做出各种尝试。传统的研究方法是用细菌经口、腹腔等途径感染动物后,间隔不同时间段将动物处死,解剖后检测各种器官的病理变化［15］,从而对BF的生长情况等作出评估。然而这一方法的不足之处在于它不能避免异质性、且不能实时动态监测BF的状况。近年来,生物发光技术正不断被人们应用于BF的研究中,它具有高灵敏度、无放射性等特点,特别是可以在同一只实验动物活体上实现动态非创伤实时监测,大大节省了实验动物成本,获得的实验数据避免了个体差异,更加直观可靠,展现了良好的应用前景［4］。

3.1 应用生物发光技术建立BF感染模型 目前,应用生物发光技术研究BF感染还处于初步研究阶段,主要为动物研究,研究者通过建立感染模型来了解BF的形成及发展。Pribaz JR等［16］建立了小鼠体内金黄色酿脓葡萄球菌BF感染模型,应用生物发光技术研究关节成形术后金黄色酿脓葡萄球菌BF感染,证实生物发光技术可长期用于监测金黄色酿脓葡萄球菌附着和BF形成。Daghighi S等［17］应用生物发光技术比较可降解和不可降解的移植生物材料上BF的生长情况。体外研究中分别在可降解和不可降解的生物材料上培养金黄色葡萄球菌Xen29 BF,通过获取的光量子数代替细菌数量,结果显示可降解材料上的光量子数更少。之后建立体内模型,将感染有金黄色葡萄球菌Xen29的生物材料植入小鼠皮下,用生物发光技术来监测BF情况,并进行微生物学和组织学评价,结果显示小鼠体内移植的可降解生物材料光量子数少于不可降解材料,且植入可降解生物材料的小鼠组织中炎症细胞数量明显少于不可降解材料。Garcez AS等［18］通过建立牙根管BF感染模型比较光动力学疗法(PDT)、标准的牙髓治疗和联合这2种方法治疗牙根管BF感染的效果。从人体提取10颗牙齿,灌注奇异变形细菌和铜绿假单胞菌来形成牙根管BF,应用生物发光技术对BF发展实时监测及定量。结果发现单独应用常规牙髓治疗方法使细菌生物发光减少90%,单独应用PDT减少95%,联合应用减少98%,且治疗后观察24 h发现联合应用比各自单独应用的细菌再生大大减少。

3.2 生物发光技术在抗菌药物有效性方面的研究 抗菌药物问世后,细菌感染在很长一段时间内受到了有效控制。但随着插管,植入假体等大量使用,BF感染日益严重,在临床上甚至面临无药可用的境地。生物发光技术可实时监测应用抗菌药物后,BF的发展情况,可帮助人们更加直观了解抗菌药物对BF的作用,以便更好地治疗BF感染。例如:Xiong YQ等［19］以金黄色葡萄球菌BF感染兔子心脏为研究模型(这里选用的金黄色葡萄球菌是对万古霉素和头孢唑啉敏感但对庆大霉素耐药的),然后分别应用万古霉素、头孢唑啉和庆大霉素进行治疗,用生物发光技术实时监测用药前后兔子心肌的发光信号,研究发现:给予万古霉素治疗3 d后心肌上的发光信号减少,然而停药3 d后发光信号却大大增加;头孢唑啉使心肌上发光信号适度减少;庆大霉素不引起发光信号减少,表明生物发光技术能快速地观察和定量抗菌药的治疗效果;Niska JA等［20］将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)植入小鼠膝关节,分别静脉注射万古霉素、达托霉素、替吉环素,通过生物发光技术显示的细菌数和BF的形成情况来比较这3种抗菌药物对MRSA和MSSA的预防能力,结果发现达托霉素和替吉环素外科植入感染MRSA和MSSA的预防剂量范围比万古霉素更广;Andreu N等［21］为了评估异烟肼对抗结核分枝杆菌的有效性做了如下实验:用携带有萤火虫荧光素酶基因的M.肺结核菌株感染小鼠,用生物发光成像技术监测动物在应用抗结核病药异烟肼前后疾病的发展变化,观察到:小鼠应用异烟肼治疗后生物发光明显减少,这一实验再次表明生物发光技术可以作为评估抗菌药物有效性的工具。

3.3 指征移植材料上的BF易感性 生物材料相关感染是现代外科手术中频繁出现的一个问题,也是导致生物材料移植失败的最主要原因,据统计,每年有超过150 000感染与外科植入感染有关,移植材料上一旦形成BF,就要进行外科手术将其移除,不仅增加了医疗费用也延长了患者的住院时间［11,20,22-23］。为了解决这一问题,人们应用生物发光技术来征移植材料上的BF易感性。为了选择不易形成BF感染的人造血管移植材料,Lorenz U等［24］以小鼠为实验模型,分别向35只小鼠皮下移植感染了能生物发光的金黄色葡萄球菌的人造血管,比较聚四氟乙烯、聚酯、牛的心包膜和表面涂有银的装置上分别形成金黄色葡萄球菌BF的易感性,结果发现涂有银的装置上活菌数最少,说明此移植材料有一定的抵抗细菌的能力,比较聚四氟乙烯和聚酯上的细菌密度,发现聚四氟乙烯的优势并不显著。Chauhan A等［25］将已形成BF的完全植入式静脉输液管(TIVAP)植入成熟大鼠体内,研究TIVAP污染的临床相关病原体,大肠杆菌,铜绿假单胞菌,金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌 BF感染,证明TIVAP这一封闭设备比起其他静脉插管可降低BF感染的风险。

4 结论

生物发光技术以其灵敏度高、非放射性、可进行实时监测、结果直观可靠等优点,正逐渐应用于BF感染研究中。但生物发光技术研究BF感染也有一些限制,如成熟的BF内部为缺氧状态,且细菌活力不高,而细菌生物发光需要氧气等条件［26］,可能造成细菌数量与其光亮强度的不对等。且由于生物发光穿透力,易被组织吸收,易受信号干扰、定位准确性等因素的限制,所以目前只应用于与实验性小动物相关的生命科学研究领域,真正进入人类临床研究尚有距离［4］。但相信随着生物发光技术的不断发展,生物发光技术会成为研究BF感染的有力工具。

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(编校:吴茜)

App lications of biolum inescence in biofilm infection

LIU Xu1,LIYue2,CAIYun2△,WANG Jin2,WANG Rui2

(1.Department of Clinical Pharmacology,PLA General Hospital,Beijing 100853,China;2.traditional Chinese Medicine,PLA General Hospital,Beijing 100853,China.)

Bacterial biofilm infection is difficult to eradicate,traditionalmethods studied animal biofilm infections spend a number of animals and it cannotmonitor the development of the biofilm,but bioluminescence technology has solved this difficulty.In recent years,bioluminescence technology has applied in the study of bacterial biofilm infection,shows good prospects.This paper reviews the bacterial bioluminescence technology'smechanism,characteristics,applications in biofilm infection model,antimicrobial effectiveness and indications on the graftmaterial biofilm susceptibility.

bioluminescent technology;bacterialbiofilm infections;infectionmodel;antibacterialeffectiveness;transplantmaterial susceptibility

R969

A

1005-1678（2014)06-0184-03

国家科技部十二五重大专项滚动课题(2012ZX09303004-002)；北京市自然科学基金(7122167)

刘旭，女，药师，研究方向：抗菌药物的合理应用 E-mail：liuxu199061@sina.com；蔡芸，通信作者，女，副研究员，研究方向：临床药理学与抗菌药物的合理应用，E-mail：caicaihh@yahoo.com.cn。