青蒿琥酯诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展

蒋红艳,姚安贵,江尚飞

(重庆医药高等专科学校 药学院,重庆 400030)

青蒿琥酯诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展

蒋红艳,姚安贵△,江尚飞

(重庆医药高等专科学校 药学院,重庆 400030)

近年来的研究表明，青蒿琥酯具有抗肿瘤活性，能够明显抑制胃癌、食管癌、结肠癌、肝癌、黑色素瘤、骨髓瘤细胞的增殖并诱导其凋亡，作用机制包括启动内源性线粒体凋亡途径，增高Bax、caspase-9及caspase-3蛋白表达，降低Bcl-2蛋白表达等。本文对青蒿琥酯诱导肿瘤细胞凋亡的作用及其机制进行综述。

青蒿琥酯；肿瘤细胞；凋亡

青蒿琥酯(artesunate,Art)属于青蒿素衍生物,由于青蒿素及其衍生物起效快、毒性低、疗效确切,已成为临床上治疗疟疾的一线药物［1-2］。近年来的研究发现,青蒿琥酯还有抗肿瘤活性,具有成为一种新的高效低毒抗肿瘤药物的潜力,其对多种肿瘤,如胃癌、食管癌、结肠癌、肝癌、黑色素瘤、骨髓瘤等起抑制作用,本文对其抗肿瘤作用机制进行大量研究,以期进一步明确其作用靶点,为青蒿琥酯的临床应用奠定基础［3］。

1 诱导肿瘤细胞凋亡

1.1 诱导人胃癌细胞凋亡 吴方红等［4］体外培养人胃癌细胞HGC27细胞,青蒿琥酯组加入青蒿琥酯终浓度为10、20、40、80、100mg/L的培养液,对照组加入等量的培养液,并设立调零孔,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)测定其对HGC27细胞增殖的影响;倒置显微镜下观察细胞的形态学变化;青蒿琥酯(浓度分别为20、40、80mg/L)处理HGC27细胞48 h后,分别采用流式细胞仪检测细胞凋亡、分光光度计检测casepase-3、caspase-9相对活性、Western blot法检RUNX-3蛋白表达情况。实验结果显示,浓度为10～100mg/L的青蒿琥酯能呈剂量和时间依赖性地抑制HGC27细胞的增殖;倒置显微镜下可观察到典型的细胞凋亡形态。浓度分别为20、40、80 mg/L的青蒿琥酯作用于HGC27细胞48h后,细胞凋亡率分别为11.5%、21.4%、36.6%,而对照组凋亡率仅为2.2%。青蒿琥酯诱导细胞凋亡的作用机制可能与其增加细胞 casepase-3、caspase-9活性以及上调RUNX-3蛋白的表达有关。此外,青蒿琥酯也能抑制人胃癌细胞SGC-7901的增殖并诱导其凋亡,其中caspase-3蛋白的高表达在促进SGC-7901细胞凋亡中起着重要作用［5］。

1.2 诱导人食管癌细胞凋亡 刘亮等［6］以浓度分别为30、60、120μmol/L的青蒿琥酯作用于食管鳞癌Ec9706细胞12 h,对照组采用生理盐水替代青蒿琥酯。于光学显微镜下观察细胞形态变化,采用流式细胞术AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡水平,荧光染料罗丹明123染色检测细胞线粒体膜电位水平。采用流式细胞术检测caspase-3蛋白表达水平。结果发现,青蒿琥酯作用于Ec9706细胞后,Ec9706细胞形态发生变化,细胞变圆,体积变小,并漂浮于细胞培养液中。不同浓度的青蒿琥酯作用于Ec9706细胞12 h后,药物呈剂量依赖性地促进Ec9706细胞的凋亡,与对照组相比具有极显著性差异(P＜0.01);药物呈剂量依赖性地降低Ec9706细胞线粒体膜电位,与对照组相比具有显著性差异(P＜0.05)。与对照组相比,青蒿琥酯组Ec9706细胞中caspase-3蛋白表达水平显著增加(P＜0.01),且呈药物剂量依赖性。因此,降低细胞线粒体膜电位,启动内源性线粒体凋亡途径,激活caspase-3蛋白等可能是青蒿琥酯诱导Ec9706细胞凋亡的机制。

1.3 诱导人结肠癌细胞凋亡 黄伟炜等［7］采用浓度分别为10,20,30μmol/L青蒿琥酯处理人结肠癌细胞HCT-8细胞后,细胞凋亡率分别为(17.1±3.8)%,(29.5±5.1)%,(41.4±5.8)%,显著高于空白对照组的(5.1±1.4)%(P＜0.05);采用浓度为20μmol/L青蒿琥酯处理人结肠癌细胞HCT-8细胞后,细胞G0/G1期所占比例随着药物作用时间延长而增加,S期与G2/M期细胞所占比例则下降;采用浓度分别为10,20,30μmol/L青蒿琥酯处理组Bax蛋白表达水平分别为(0.20±0.03),(0.40±0.05)和(0.50±0.08),显著高于空白对照组的(0.06±0.02)(P＜0.05);Bcl-2蛋白表达水平未见明显变化,Bcl-2/Bax呈下降趋势。因此,青蒿琥酯诱导凋亡人结肠癌细胞HCT-8细胞的作用机制可能与其阻滞结肠癌细胞周期、上调促癌基因Bax表达有关。

1.4 诱导人胃腺癌细胞凋亡 朱奔奔等［8］研究了青蒿琥酯对人胃腺癌MKN45细胞株增殖抑制和诱导凋亡作用,将不同浓度的青蒿琥酯作用于体外培养的人胃腺癌MKN45细胞株,空白对照组加入等体积的培养基,采用MTT检测细胞生长抑制率;采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;应用Western Blot法检测不同浓度的青蒿琥酯处理MKN45细胞株后凋亡相关蛋白Bax、caspase-9及caspase-3等表达情况。MTT实验结果显示,青蒿琥酯对MKN45细胞增殖有显著的抑制作用,且对细胞增殖抑制作用与药物作用时间和浓度呈正相关(P＜0.05)。并随着青蒿琥酯浓度的增加,MKN45细胞凋亡率逐渐升高(P＜0.05)。ART使MKN45细胞 Bcl-2蛋白表达明显降低,Bax、caspase-9及caspase-3蛋白表达明显增高,且对凋亡相关蛋白表达的调控作用与药物浓度呈正相关。

1.5 诱导人肝癌细胞凋亡 雷佳红等［9］采用青蒿琥酯(3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL)处理人肝癌 HepG2 细胞 48 h,药物呈浓度依赖性地促进HepG2细胞的凋亡,且当青蒿琥酯浓度在6.25μg/mL以上时,各组凋亡率与对照组比较有极显著性差异(P＜0.01),细胞发生凋亡形态学改变。各组caspase-3的表达与对照组比较极显著性差异(P＜0.01)。因此认为青蒿琥酯能够显著诱导HepG2细胞凋亡,其机制可能与增强凋亡相关基因caspase-3的表达有关。

1.6 诱导人白血病细胞凋亡 黄利华［10］提取11例急性白血病患者骨髓液进行原代细胞培养,以对数生长期细胞为干预点,实验组将不同浓度青蒿琥酯作用于细胞,对照组加入等体积的培养液,分别采用MTT法检测青蒿琥酯对人AL原代细胞增殖的影响;透射电子显微镜观察青蒿琥酯作用后细胞的形态变化;免疫印迹法检测凋亡相关蛋白。其研究结果显示,与对照组比较,各剂量组青蒿琥酯作用于人白血病原代细胞48 h后细胞形态呈现2种不同的形式:胀亡,细胞体积明显增大,细胞浆呈空泡样改变,细胞膜部分完整,线粒体肿胀,细胞核多被挤向细胞一侧;凋亡,细胞体积缩小,染色质固缩,或裂解形成1个或数个大小不一的致密凋亡小体。青蒿琥酯处理细胞48 h,可下调凋亡抑制蛋白Bcl-2含量,促进凋亡蛋白Bax、C-myc的释放。推测其抗白血病作用的分子机制可能是线粒体途径,但其最佳作用靶点有待研究。

1.7 诱导人子宫内膜癌细胞凋亡 王利娟等［11］探讨了青蒿琥酯抑制人子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖及诱导其凋亡的机制,MTT实验显示青蒿琥酯能够呈剂量-时间依赖性地抑制HEC-1B细胞生长;流式细胞仪检测显示青蒿琥酯能够使G0/G1期细胞比例上升(P＜0.05),G2/M期细胞比例下降(P＜0.05);检测凋亡率实验结果显示,实验组与对照组相比,5mg/L青蒿琥酯组凋亡率无统计学差异,20、80 mg/L青蒿琥酯组凋亡率均有统计学差异(P＜0.05);RT-PCR结果显示,青蒿琥酯组Livin mRNA表达下调,caspase-3 mRNA表达上调。因此,青蒿琥酯抑制人子宫内膜癌细胞HEC-1B的增殖,诱导其凋亡,其作用机制可能是通过抑制Livin mRNA表达、进而增加caspase-3 mRNA表达,诱导子宫内膜癌HEC-1B细胞发生细胞周期阻滞有关。

1.8 诱导骨髓瘤细胞凋亡 王素云等［12］研究表明,浓度为25～50μg/mL的青蒿琥酯对骨髓瘤RPMI8226细胞的抑制率为33.55%～74.71%。浓度为50μg/mL青蒿琥酯诱导RPMI8226细胞最大凋亡率达(68.1±5.9)%。采用不同浓度青蒿琥酯处理骨髓瘤RPMI8226细胞48 h后,Survivin mRNA及蛋白表达水平明显降低,caspase-3、caspase-7 mRNA及蛋白活性明显升高(P＜0.01)。因此,青蒿琥酯增强caspase-3、caspase-7活性,抑制抗凋亡分子survivin表达可能是其抑制骨髓瘤RPMI8226细胞、诱导骨髓瘤RPMI8226细胞凋亡的机制。

1.9 诱导黑素瘤细胞凋亡 肖敏等［13］观察了青蒿琥酯对人皮肤恶性黑素瘤A875细胞增殖和凋亡的影响,并探讨相关机制。MTT实验结果显示不同浓度的青蒿琥酯能有效抑制A875细胞的增殖,并呈浓度依赖性;Annexin V/PI双染法流式细胞术结果显示,青蒿琥酯能够诱导A875细胞凋亡,并呈浓度依赖性。Western blot结果显示不同浓度青蒿琥酯作用A875细胞后,caspase-3、caspase-8及caspase-9的蛋白表达水平均出现增高,并呈剂量依赖性,提示青蒿琥酯诱导A875细胞凋亡与上调caspase-8、caspase-9以及caspase-3有关。

1.10 诱导T细胞淋巴瘤细胞株凋亡 陈均法等［14］采用MTT比色法检测青蒿琥酯对T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat细胞体外生长的抑制作用;采用细胞形态学、DNA琼脂糖凝胶电泳、DNA的PI染色等观察和检测Jurkat细胞的凋亡;采用Western blot法检测Jurkat细胞凋亡过程中Bc-2、Bax、caspase-8和ICAD蛋白表达水平的变化。结果显示,以浓度为2～64μg/mL青蒿琥酯作用T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat细胞,能够抑制细胞增殖,促进Jurkat细胞凋亡;随着药物浓度的增加,Bcl-2和ICAD蛋白表达逐渐下降,而Bax蛋白表达上调,caspase-8蛋白出现明显的剪切激活带;提示青蒿琥酯既可通过线粒体途径又可通过外源性途径诱导T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat细胞凋亡,但还需进一步研究具体的信号转导机制。

2 作用机制

肿瘤的发生与细胞凋亡的调节紊乱具有非常密切的关系,细胞凋亡对肿瘤的发生起负调控作用。基因水平上促细胞凋亡基因如p53等的失活,以及抗细胞凋亡基因如Bcl-2,Survivin等的过度表达,是肿瘤发生的重要原因。在正常组织中Bcl-2几乎不表达,而在肿瘤细胞中Bcl-2表达增高,且与细胞的分化程度有关［15-16］。Caspase家族是肿瘤细胞凋亡起始和执行过程中非常重要的一系列蛋白因子,是细胞凋亡的核心,caspase家族与Bcl-2家族互相影响。Bcl-2抗凋亡相关蛋白可通过抑制线粒体膜电位、抑制caspase的活化。caspase-3是caspase家族中关键的凋亡执行者,caspase-8、caspase-9是其中的重要蛋白,且procaspase-8、procaspase-9等分别从不同角度参与调控细胞凋亡［17］。青蒿琥酯能够抑制多种肿瘤细胞的生长,并促进其凋亡,其作用机制可能与降低细胞线粒体膜电位,启动内源性线粒体凋亡途径,增高 Bax、caspase-9及 caspase-3蛋白表达,降低Bcl-2蛋白表达等相关。但由于细胞凋亡的发生机制很复杂,引起细胞凋亡的因素很多,且既往的研究多为体外实验,因此,青蒿琥酯抗肿瘤的体内作用机制还有待进一步研究。

3 讨论

青蒿琥酯作为青蒿素的水溶性衍生物,除了具有抗疟作用外,还有许多新作用,而其抗肿瘤作用更是引起人们的广泛关注,临床应用前途广泛。随着其抗肿瘤作用的不断深入探索和临床研究的开展,青蒿琥酯应用于多种肿瘤的治疗前景广阔。

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(编校:谭玲)

Research progresses of artesunate in inducing tumor cell apoptosis

JIANG Hong-yan,YAO An-gui△,JIANG Shang-fei

(College of Pharmacy,Chongqing Medical and Pharmaceutical College,Chongqing 400030,China)

In recent years,studies have shown thatartesunate has anti-tumor activity,and could inhibit gastric cancer,esophageal cancer,colon cancer,liver cancer,melanoma,myeloma cell proliferation and induce apoptosis mechanisms including to start within endogenous mitochondrial apoptotic pathway,increase Bax,caspase-9 and caspase-3 protein expression,and reduce Bcl-2 protein expression and so on.In this paper,the effect and mechanism of artesunate inducing tumor cell apoptosis are reviewed.

artesunate;tumor cell;apoptosis

TN248.1

A

1005-1678（2014)06-0181-03

重庆市教委科研项目(KJ1402601)；重庆市卫生局医学科研项目(2012-1-093)；重庆市卫生局中医药科技项目(2012-2-17)

蒋红艳，女，研究生，副教授，研究方向：中药药理，E-mail：jianghy200568@126.com；姚安贵，通信作者，男，本科，副教授，研究方向：临床医学，E-mail：jianghy200568@sina.com。