角膜上皮细胞代谢的研究进展

马佰凯 何昕 李炜

角膜上皮细胞位于角膜外表面，由4-5层非角化鳞状上皮细胞组成，在维持眼表稳态以及角膜透明度中发挥重要作用。正常的角膜上皮细胞代谢与其增殖分化有密切关系，很多疾病也与其代谢密切相关。本文总结角膜上皮细胞代谢的研究进展，旨在为角膜上皮代谢相关的研究提供参考与建议。

一、角膜上皮细胞的结构特点

角膜上皮的厚度约为55 μm，约占角膜总厚度的10﹪，包含三种细胞类型：鳞状细胞、翼状细胞和基底细胞。角膜上皮表面与泪膜相接触，表层上皮细胞表面具有微绒毛和微褶皱，已有研究表明微绒毛和微皱褶对角膜前泪膜的滞留、泪液内营养和代谢物质的吸收和交换起重要作用[1-2]。角膜基底层上皮细胞与基底膜、前弹力层的连接主要是借助于半桥粒等结构而实现的[3-4]，这些连接在维持角膜上皮的良好状态上起到了重要的作用[5]。角膜上皮细胞之间通过高表达紧密连接蛋白Claudin、ZO、Occludin等参与构成角膜的屏障系统[6-8]。它对溶质和大分子的运输也起重要的调节作用[9]，可通过水通道蛋白外排钠离子、氯离子以及水分子，从而维持角膜基质层的脱水状态，保持角膜透明性[10]。结合角膜上皮无血管的特性，若能证明角膜上皮细胞间的紧密连接在物质扩散中起一定作用，将有助于我们深入了解角膜上皮细胞代谢的途径。相邻的上皮细胞间有10～20 μm的间隙，间隙中存留有由酸性黏多糖、蛋白质等形成的低电子密度物质，具有黏合作用，这类物质统称为桥粒结构。桥粒以闭锁小带的方式使两个上皮细胞相互黏连，桥粒结构中的一些蛋白如E-钙黏蛋白在信号通路中起调节作用[11]，但是这些连接蛋白及连接方式是否参与上皮细胞代谢的过程与调节尚不清楚。

二、角膜上皮细胞的营养来源与代谢方式

角膜的营养物质有三个来源：角膜周围毛细血管、泪液和前房水[12]。周边部角膜的代谢主要依靠角膜缘血管网，中央部角膜的营养物质则通过角膜上皮细胞或内皮细胞进入角膜内。葡萄糖和糖原是上皮细胞的产能物质，葡萄糖的直接来源主要是房水，约10﹪是从角膜缘和泪膜扩散得来。角膜上皮细胞具有一定的糖原储备[13]，葡萄糖也可由糖原分解产生。从内皮层至上皮层，乳酸含量增多而葡萄糖与碳酸氢盐含量降低[14]。已有证据说明兔角膜上皮细胞中线粒体含量较少[15]，兔角膜中糖代谢的主要方式是无氧糖酵解，占85﹪，剩余为有氧氧化[16-17]，由于有氧氧化释放的ATP很多，且不产生代谢废物，所以在角膜上皮细胞代谢中仍发挥重要作用。然而，人角膜上皮中糖酵解与有氧氧化的比例仍不清楚。糖酵解途径可以产生大量乳酸，正常泪膜中含有乳酸脱氢酶[18]，由此推测乳酸可能被转运至泪膜中进行分解，具体机制还有待进一步研究。

有研究发现角膜上皮选择性高表达脂肪氧化酶15[19-20]，提示脂类有可能作为角膜上皮细胞的能量来源。脂质通过脂肪动员形成甘油和脂肪酸，甘油可以通过糖异生转变为葡萄糖，脂肪酸可以通过beta-氧化产物进入三羧酸循环，如能证明角膜上皮细胞表达其中关键酶或相关产物，则可以证明这条能量来源途径的可行性。

三、角膜上皮细胞的氧气来源与代谢

大气供应角膜上皮有氧代谢所需的大部分氧气并且能抑制缺氧性肿胀[14]，角膜缘血管网和房水也能提供少量氧需求。睁眼时，氧气自角膜向房水内渗透，睡眠时，由结膜血管和房水提供氧气。正常代谢情况下，睁眼时中央角膜上皮氧分压约为105～155 mmHg，闭眼时其值约为22～61.5 mmHg[14,21]，角膜缘上皮细胞也有低水平的缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)的mRNA表达[22]，对缺氧情况下角膜上皮细胞的代谢有一定作用。正常情况下葡萄糖代谢过程中糖酵解尚且比有氧氧化占更大的比例，在夜晚闭眼或者佩戴接触镜的情况下，角膜上皮细胞缺氧会更严重，糖酵解所占据的比例更大，从而产生更多的乳酸，糖原也会大量消耗，屏障系统受损，角膜易出现炎症或感染[23-24]。由于睡眠是间断性、生理性的，所以机体具有一定的调节机制，睁眼情况下得到改善，具体的生理机制还有待研究。长期佩戴接触镜可能使角膜上皮细胞始终处于缺氧状态，从而导致各种缺氧并发症。

四、泪液在角膜上皮细胞代谢中的作用

1.泪膜的组成：泪膜可分为三层，包括最表面的脂质层，中间的水性泪液层，以及最内层的黏液层。脂质层的厚度为20～160nm[25]，由蜡酯、胆固醇以及脂肪酯酸等构成，包括与外界空气接触的较厚的非极性脂肪层，和靠近水性泪液层较薄的极性脂肪层[26]。水性泪液层主要包含泪腺及副泪腺分泌的水、蛋白质和电解质成分，其中水的含量占泪液总量的98﹪以上。泪液的蛋白质和电解质与血清均有差异，泪液中氯离子和钾离子浓度要高于血清，但葡萄糖浓度要低于血清。正常泪液渗透压为300～305 mOsm/l。正常泪液的蛋白质含量大约为6～10 mg/ml，总蛋白质种类超过1500种[27]。黏液层由结膜杯状细胞以及结膜、角膜上皮细胞分泌，主要成分为黏蛋白、硫黏蛋白、cyalomucin等，现在发现的眼表面黏蛋白有7种，包括分泌型的黏蛋白2（mucin2,MUC2）、MUC5AC、MUC5B、MUC7和膜结合型的 MUC1、MUC4、MUC16[28-29]。

2.泪膜的功能：泪膜的功能可归纳如下：（1）形成并维持角膜光滑的折射表面；（2）维持角膜和结膜上皮细胞的湿润环境；（3）有杀菌作用；（4）润滑眼睑；（5）在上皮层和实质浅层之间输送代谢产物(主要是氧和二氧化碳)；（6）在损伤病理途径中提供白细胞通路；（7）稀释及清除有害刺激物，包括上皮碎屑、细菌、异物等。

3.泪膜在角膜上皮细胞代谢中的作用：角膜上皮细胞与泪膜紧密接触。泪膜在角膜上皮细胞代谢中可能发挥的作用正逐渐引起人们的重视。泪膜中葡萄糖含量很少，但富含脂质，而且角膜上皮细胞具有脂性屏障，脂溶性和非极性物质易通过，表明角膜上皮细胞有可能从泪膜中摄取脂质来获得代谢所必需的营养来源。泪膜的脂质层还可以减少泪水的挥发，协助维持湿润的眼表，同时保护眼睛免受微生物或者其他异物如灰尘、花粉的伤害[30]，从而为正常的角膜上皮细胞代谢提供良好的微环境。

泪膜中其它成分在角膜上皮细胞代谢中也发挥重要作用。黏蛋白作为黏液层的主要成分，可以通过包裹外来物质发挥眼表防御作用[31]，高浓度的溶菌酶可溶解细菌细胞壁而保持眼表正常微环境[32-33]。乳铁蛋白除抗菌外还可结合自由基从而抑制脂质过氧化[34]。免疫球蛋白A构成宿主眼表的第一道防线。这些泪膜成分一起构成了角膜上皮细胞代谢的正常微环境。

当泪液生成减少或蒸发过量时会造成泪液的缺失，引起干眼。睑板腺功能障碍会造成泪膜的改变、脂酶分泌增加和细菌的繁殖，进而引起眼表的炎症反应或损伤。不稳定的泪膜本身也会引起干眼症状[35]。当泪液发生功能障碍时，其组成成分的质与量发生改变，会影响角膜从泪液中汲取氧气及营养，同时也会引起角膜、结膜的炎性损伤。当泪液减少时，眼表面的乳酸脱氢酶可能减少，可导致乳酸清除障碍。至于干眼时角膜上皮细胞如何发生代谢异常进而影响上皮细胞的增殖与凋亡，破坏角膜上皮的完整性都还有待研究。

五、角膜上皮细胞代谢与细胞增殖、分化的关系

1.正常情况下角膜上皮细胞的增殖与分化：成熟角膜上皮细胞由角膜缘基底部干细胞增殖分化而来[36]。在正常情况下，角膜上皮干细胞表现较低的增殖状态，分裂时产生短暂扩充细胞（transient amplifying cell,TAC），TAC增殖数次后脱离基底膜，向上皮表面和角膜中央迁移并继续增殖，逐步分化为终末分化细胞，即成熟角膜上皮细胞，使其持续更新以维持生理功能[37]。

2.角膜上皮干细胞的代谢特点：角膜上皮干细胞具有某些独特的特征，包括较长的生存时间，强大的自我更新能力，细胞周期长，S期持续时间短，无错增殖，不分化等[38]。相比中央角膜，角膜缘上皮基底细胞中含有高浓度的代谢相关酶类，如细胞色素氧化酶[39]、钠-钾-ATP酶[40]和碳酸酐酶[41]，而醛脱氢酶[42]与酮基转移酶[43]浓度则比中央角膜上皮小很多，参与糖酵解的α-烯醇化酶在角膜缘上皮细胞含量也较多[44]，说明角膜缘上皮干细胞代谢更活跃。

3.创伤情况下角膜上皮细胞的增殖、分化与代谢：角膜上皮细胞位于角膜最外层，最易受到伤害，当角膜上皮细胞受到物理、化学或生物损伤时，细胞代谢发生紊乱，为及时修复其机能，细胞启动自身修复机制。受损区周边上皮细胞参与其中，角膜上皮受损约1h后，未受损区的上皮细胞扩大变平，伸出伪足，以阿米巴的形式迁移至受损区并增殖，迁移的能量来源于上皮细胞中储存的糖原[45]，并发生有丝分裂，大约6周后上皮与基底膜贴紧。毗邻受伤部位可见基质细胞凋亡，远离受伤部位则可见角膜基质细胞转变为激活的纤维母细胞并迁移至受伤部位[46]。同时，角膜缘干细胞加速增殖分化为角膜上皮细胞。

细胞代谢中的中间物与酶在损伤修复中的作用历来为人们研究的焦点。Notch1信号通过调控维生素A代谢中的细胞视黄醇结合蛋白-1（cellular retinol-binding protein1，CRBP1）在角膜上皮细胞损伤修复的过程中起重要作用[47],维生素D3抑制绿脓假单胞菌入侵过程中白介素-1β（IL-1β）、IL-6和IL-8炎症因子与趋化因子的表达[48]，乳酸脱氢酶作为角膜上皮细胞无氧代谢中转化乳酸[49-50]和提供能量[45]的重要因子，同时被证明可以作为角膜上皮细胞分化的标志[51]。在家兔体内还可以诱导12-脂氧酶（12-lipoxidase，12-LOX）并合成 12（S）羟基二十碳四烯酸（12(S)- hydroxy-eicosatetraenoic acid，12(S)-HETE）加快细胞增殖以修复损伤[52]。醛脱氢酶3A1在角膜上皮细胞中高表达，通过其自身的氧化作用与延长细胞周期的功能可以保护角膜上皮细胞免受氧化性损伤[53]。在离体培养眼球过程中，角膜受到划伤或碱侵蚀时，角膜上皮细胞中糖酵解途径增多，蛋白结合型还原型辅酶Ⅱ(triphosphopyridine nucleotide，NADPH)转变为游离NADPH增多[54]。很多脂质在角膜上皮细胞损伤修复中起重要作用，如眼表炎症时，花生四烯酸、12[S]-HETE（12(S)- hydroxy-eicosatetraenoic acid）、15[S]-HETE（15(S)- hydroxy-eicosatetraenoic acid）作为第二信使促进细胞增殖，一些脂酸合酶的衍生物可参与抑制炎症[55]，花生四烯酸还可以转化为前列腺素、白三烯和碳四烯酸抑制炎症损伤[56]。

细胞代谢的调节因子也在修复损伤中发挥重要作用。促炎因子IL-1β与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）上调基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）在角膜上皮细胞中的表达，对伤口的愈合与角膜基质的降解起重要作用[57]。角膜损伤状态下高表达的热休克蛋白27(heat shock protein-27，HSP-27)被证明是不同类型细胞中抗细胞凋亡的介导因子[58-59]。乙酰胆碱可促进受损角膜上皮的修复[60]。表皮生长因子可通过诱导活性氧生成[61]和通过上调细胞周期蛋白D1(cyclinD1)和细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase4,CDK4）、下调p27[62]促进角膜上皮细胞增殖和损伤修复。人类角膜上皮细胞储存、释放神经生长因子(nerve growth factor,NGF)，在角膜受损后一过性升高，可加速愈合[63]。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）在伤口愈合中促进角膜上皮细胞的增殖与迁移[64-65]，并可以保护细胞免受低氧诱导的细胞凋亡[66-67]。胸腺素β4通过降低中性粒细胞的浸润和炎性细胞因子、趋化因子的mRNA水平来促进角膜的损伤修复[68]。基膜聚糖在角膜上皮出现受损时可调节细胞的黏附、迁移，有助于角膜的损伤修复[69]。透明质酸和白细胞分化抗原分化群44(cluster of differentiation 44,CD44)相互支持促进角膜上皮细胞的迁移，从而促进受损角膜的修复[70]。

六、角膜上皮细胞代谢相关性疾病

1.角膜上皮病变对代谢的影响：角膜上皮细胞在遭受物理、化学或者生物方面的损伤时，会出现相应的结构改变、成分失调以及代谢紊乱，导致上皮细胞凋亡、坏死或异常分化。

一些角膜上皮变性性疾病也与上皮细胞代谢有关，如Terrien角膜边缘变性推测继发于营养障碍性疾病、泪液成分异常等情况，会造成角膜缘新生血管生成和脂质浸润[71]。Meesmann角膜营养不良和角膜上皮基底膜营养不良会造成角膜上皮的反复糜烂，形成角膜瘢痕，影响视力，这些细胞内有糖原染色阳性的不明沉积物存在[72]。

2.全身性代谢性疾病在眼表的表现：很多全身性疾病在眼表也有病变表现，如糖尿病会造成眼表的鳞状化生，杯状细胞的缺失，从而致使泪膜的质与量失调，造成新陈代谢紊乱并发生周围神经病变[73]。糖尿病也会影响泪腺的功能，造成泪液产生减少[74]，引起干眼症。同时也会造成角膜水、离子物质的通透性增加，影响角膜的代谢[75]。糖尿病患者泪膜脂质层的非均一性，角膜的敏感性，泪膜的破裂时间均遭到破坏，泪膜脂质层与糖尿病性角膜病有密切关系[76]。角膜上皮表面的微绒毛、微皱褶也会随着病程逐渐减少[77]，进一步影响角膜上皮细胞代谢。

3.角膜上皮细胞内环境改变引起的病变：角膜上皮所处内环境的变化也会引起相应病变，如高渗泪液被证实为干眼症中角膜上皮相应病变的起始因素之一[78]，同时可以通过谷氨酰基转移酶-2（transglutaminase-2， TGM-2）致线粒体损伤，导致细胞代谢紊乱[79]，缺氧环境下细菌性角膜炎的危险性提高[80]。角膜上皮发生病变后会导致代谢异常，无法正常吸收利用营养物质，细胞内信号通路受损，增殖分化异常，生理功能损伤或丧失。

4.佩戴接触镜对角膜上皮代谢的影响：长期佩戴接触镜会造成角膜低氧、高碳酸血症，会引起角膜上皮、基质、内皮的显著变化，这些变化也会随着睡眠周期而变化，上皮的变化包括代谢速率的下降，形态学的改变，出现滤泡，交界完整性改变，角膜知觉减退，血管翳形成等[81]。

七、角膜上皮细胞代谢研究的展望

角膜作为眼表最重要的光学结构，历来为眼表研究的焦点。角膜上皮由于特殊的位置、结构及周边环境，其代谢具有不同于其它组织的特点。如泪膜脂质在角膜上皮细胞代谢中的作用，角膜上皮不同部位氧气代谢的特点，角膜上皮细胞代谢产物的排出机制等等，针对这些问题的研究将有助于揭示角膜上皮细胞增殖与分化的机制，有助于深入认识角膜上皮病变的病理生理过程。同时，眼部其他部位病变以及全身性疾病对角膜上皮细胞代谢的影响也受到越来越多的关注，也将是今后研究的热点。

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