组织工程角膜的基础研究和临床应用现状

周庆军 谢立信

角膜病是我国第二大致盲性眼病。根据我国多中心流行病学调查结果，全国有单眼和双眼角膜盲人301.5万，其中多数患者都可通过穿透性或板层角膜移植治疗复明，但我国角膜供体材料缺乏，每年只有5000名患者通过角膜移植手术复明，远远不能满足临床需求。因此，开发组织工程化角膜具有极高的临床应用前景[1]。近20年来，随着组织工程学的广泛和深入研究，组织工程角膜，尤其是组织工程角膜上皮和基质方面都取得了显著的进展，在动物水平或临床应用中也取得了较好的治疗效果。本文对组织工程全角膜、角膜上皮、基质和内皮方面的研究进展和应用情况进行归纳介绍，并对其临床前景、存在问题和发展策略进行讨论。

一、组织工程角膜

理想的组织工程角膜应包含角膜上皮、基质和内皮三部分成分。1999年，Griffith等[2]利用病毒转染永生化的人角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞，结合戊二醛交联过的胶原-硫酸软骨素复合材料作为支架，构建了全层的组织工程角膜替代物，具有较正常的透明性，以及对外界刺激的反应性。随后也有多个研究组的成果相继发表，但到目前为止，仍未有进入临床研究的报道，基于永生化细胞的安全性和支架材料本身的长期效果考虑，组织工程化全角膜的开发和临床应用还有很大的困难。

二、组织工程角膜上皮

组织工程角膜上皮的构建需要具有自我更新能力的上皮干细胞，并结合合适的载体材料进行培养，形成重组上皮膜片。

在组织工程角膜上皮构建的种子细胞方面，自1997年，Pellegrini研究组首次发现体外培养的小量健康人角膜缘上皮可以在体外形成完整的上皮细胞层，临床移植取得成功以来，采用体外培养的角膜缘上皮、口腔黏膜上皮移植治疗角膜缘干细胞缺乏已在美国、日本、意大利和韩国等获得批准应用于临床，并取得了良好的临床效果，从已报道的病例来看，培养的自体角膜缘干细胞移植成功率多在70﹪[3-4]。根据眼表损伤情况，单眼角膜缘干细胞缺乏患者多选用自体健眼角膜缘取材，双眼损伤患者多选用亲属角膜缘或异体角膜缘取材。除自体或异体角膜缘干细胞、自体口腔黏膜上皮干细胞外[5-7]，目前处于研究阶段的种子细胞来源还包括骨髓间充质干细胞、表皮干细胞、羊膜上皮细胞、结膜上皮细胞、胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES细胞）或诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS细胞），但应注意的是：与正常的角膜缘上皮细胞相比，非角膜上皮来源的细胞在功能上可能存在差异，如口腔黏膜上皮血管形成抑制因子表达量偏低，而促进新生血管的相关因子表达量偏高，可导致移植后角膜新生血管复发的潜在风险[8]。ES/iPS细胞虽然来源广泛、具有无限增殖能力，但目前主要面临着安全性（未分化细胞的残存有致瘤风险）和有效性（是否能分化成具有角膜上皮功能的细胞）的问题[9]。此外，虽然采用小鼠胚胎成纤维细胞（如3T3细胞系）和含动物成分（血清）培养体系构建的组织工程角膜上皮已获得多个国家的临床批准，但开发无动物源性的干细胞体外扩增体系，降低风险仍是组织工程角膜上皮研发的长期任务之一。

在组织工程角膜上皮构建的载体方面，目前的多数研究选用羊膜或纤维蛋白胶。羊膜载体的优点在于来源广泛、处理方便，同时具有较强的抗炎、抗新生血管作用，并能维持角膜缘干细胞的活性和功能。纤维蛋白胶作为一种新型的生物可降解的组织粘合剂和局部止血药，国际上已广泛用于外科领域。与羊膜相比，纤维蛋白胶的组织相容性和透明度更好，成分更为明确，体内吸收速度快，也可维持干细胞的克隆形成能力和上皮分化程度[10]。此外，以温度敏感性合成材料为基础构建无载体的上皮膜片是近年来的重要进展之一，使用该材料可以获得完整的上皮膜片，近年来已有构建的口腔黏膜和角膜上皮细胞膜片用于临床的报道[6,11]。

三、组织工程角膜基质

角膜基质是维持角膜透明性的关键结构成分，因此，寻找具有类似天然角膜基质结构和生化成分的角膜基质替代物是组织工程角膜研发的重点之一。天然的角膜基质以胶原成分为主，细胞成分少，最接近自然状态的支架材料是脱细胞处理的角膜片，目前的研究重点是如何在保持角膜基质成分、结构和透明性的同时，尽可能去除其细胞和抗原成分。联合应用物理、化学和酶消化是目前最常用的脱细胞角膜处理方法，国内已有多家单位对脱细胞猪角膜进行了研究，目前已有部分进入临床前研究[12-14]。在合成材料方面，近年来研究者主要围绕交联化的胶原支架开展研究工作[15]，2010年，Griffith研究组对10名圆锥角膜或角膜瘢痕的患者，采用乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺（EDC）交联的人胶原材料为支架的材料进行移植治疗，通过2年的观察发现，全部患者角膜均实现上皮化，且无新生血管形成，移植物在角膜内保持稳定，角膜敏感性恢复，角膜基质细胞和神经纤维已长入移植物，其中6人视力恢复明显[16]。因此，无论是天然材料还是合成材料，组织工程角膜基质在基础研究领域都取得了显著的进展，但在临床治疗方面，尤其是长期的安全性和有效性方面还需要进一步观察。

四、组织工程角膜内皮

人角膜内皮在体内无再生能力，因此，获得具有再生能力和正常功能的角膜内皮细胞是组织工程角膜面临的最大难题。虽然有学者利用病毒转染或体外培养获得了永生化的角膜内皮细胞系，但临床应用的安全性需要进一步研究。近年来，采用ES细胞或其他成体类的干细胞诱导分化为角膜内皮细胞取得了一定的进展，但限于角膜内皮细胞没有特异性的检测方法，分化细胞的性质和功能鉴定还存在问题。近年来，国内外学者通过组学技术，结合抗体筛选，相继发现了多个角膜内皮细胞的特异性标志，为角膜内皮细胞分化的鉴定奠定了良好的基础[17-18]。同时有多个研究组报道在角膜周边部可能存在角膜内皮干(祖)细胞[19]，如何实现角膜内皮干(祖)细胞的体内再生，或体外扩增后构建组织工程角膜内皮进行移植治疗也是很有前景的工作[20]。此外，也有学者尝试了血管内皮细胞、骨髓间充质干细胞等替代角膜内皮细胞的可行性，但长期的有效性和安全性仍鲜有报道。

五、存在的问题

1.基础研究方面：在组织工程角膜上皮移植治疗中，移植成功率与其中表达ΔNp63α、能形成大克隆（Holoclone）的干细胞比例有关，如果干细胞比例大于3﹪，移植成功率会有78﹪；但若小于3﹪，成功率只有11﹪，因此，维持组织工程角膜上皮中具有Hococlone形成能力的干细胞比例对于移植是否能成功至关重要[7]，应对重组上皮临床移植前进行评价。此外，目前关于角膜缘干细胞的研究多是出于临床应用目的进行的试验性探索，而针对角膜缘干细胞生物学特性的基础研究仍很薄弱，如角膜缘干细胞的特异性标志、角膜缘干细胞niche的主要组成及其与干细胞间的相互作用、角膜缘干细胞抑制新生血管的调控机制、重组上皮膜片移植前的实时检测评价、体外培养的异体干细胞的免疫相容性等问题都有待于深入的基础研究。对于组织工程角膜内皮，目前的主要问题还是如何获取足够数量、具有角膜内皮功能的种子细胞，以及在移植前对培养的内皮细胞进行功能评价。

2.临床应用方面：组织工程角膜的构建需要严格的标准化操作，尤其是干细胞的培养、检测和鉴定都需要专业人员，因此组织工程角膜产品的生产应集中在能覆盖全国的几个中心进行标准化操作。在手术方面，虽然有众多的报道，但在病例选择、供体材料、培养方法和判定移植效果方面的参考指标都不尽相同，长期治疗效果的报道较少[21]，因此需要制定相对标准化的评价指标，以便更客观的评价组织工程角膜的长期移植效果。此外，目前的组织工程角膜上皮移植多针对单纯角膜缘干细胞缺乏症的患者，但我国角膜缘干细胞缺乏症患者，多伴有化学或热烧伤引起的结膜和其他眼表结构缺损，对于这类患者，首先必须获得大直径的组织工程上皮植片，在术中用于修复结膜，重建穹窿，否则角膜重建手术基本都会失败[22]。因此，研究人员不但要重视组织工程角膜的研发，更要重视组织工程结膜、泪腺等眼表重要功能结构的重建，为我国眼表严重损伤的患者复明做出贡献。

六、总结

近年来，虽然采用组织工程角膜上皮治疗角膜缘干细胞缺乏症，以及组织工程角膜基质治疗角膜瘢痕、角膜感染、圆锥角膜等方面取得了显著的进展，但还没有一种产品通过国家食品药品监督管理局的临床应用许可。但值得注意的是，国家一直在尝试制定政策引导干细胞临床试验，相继出台了《组织工程化组织移植治疗技术管理规范》、《干细胞临床试验研究管理办法（试行）》等一系列管理办法和规范，考虑到组织工程化角膜的构建和移植都需要较高的技术要求，因此，探索通过建立干细胞临床试验研究基地，开展组织工程角膜的临床试验研究是十分必要的。

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