损伤性ED动物模型研究进展

崔志强宋鲁杰综述 卢洪凯王永传审校

1. 山东省潍坊市中医院泌尿外科（潍坊 261041）;

2.上海交通大学附属第六人民医院泌尿外科; 3.潍坊市人民医院泌尿外科

·综 述·

损伤性ED动物模型研究进展

崔志强1宋鲁杰2综述 卢洪凯3王永传1审校

1. 山东省潍坊市中医院泌尿外科（潍坊 261041）;

2.上海交通大学附属第六人民医院泌尿外科; 3.潍坊市人民医院泌尿外科

近年来，前列腺根治术（RP）和根治性膀胱切除术、外伤所致的骨盆骨折和尿道断裂（pelvic fracture urethral disruption, PFUD）以及骨盆和后尿道手术的患者不断增多，其可对CN产生不同方式及程度的损伤，ED作为它们并发之一，发病率也不断增加，国外文献报道保留单侧和双侧神经血管束（NVB）的RP后ED发病率分别为76%和53%[1]，PFUD患者ED发生率高达42%[2]，后尿道端端吻合术后ED的发生率为56%[3]。ED可对男性及其配偶的身体和心理健康产生重要的影响[4]，为此，许多科学家参与了对ED的研究。1863年，Eckhard[5]首次报道了盆腔神经在勃起功能中的重要性，提出了ED的基本概念，并增加了我们对ED病理生理学的认识[6]。通过对调节勃起的神经生理学的研究，发现许多激素和神经递质对阴茎勃起起到重要作用[7]。虽然人类性功能复杂的属性不可能被完全复制，但是动物模型是研究和评估ED的重要方式。现将损伤性ED动物模型的相关研究进展综述如下。

一、动物的选择

虽然狗、猴子、猫和兔子等大动物在早期（1960-1990）常被作为研究勃起功能的模型，但是啮齿类动物已在很大程度上取代这些大的动物作为主要的动物模型，主要有以下几个原因：第一是实验费用方面，啮齿类动物比大动物更经济；第二是啮齿类动物模型已被充分证明具有和人类相似的形态和功能；第三是手术操作和CN解剖方面，啮齿动物模型很更简单、容易；第四是由于啮齿类动物寿命较短，在此期间内，可以通过检测动物的生物反应评估疾病状态和治疗性干预的效果[8]。虽然啮齿类动物模型在ED研究中有许多优点，但是它不能代表人类复杂的性行为和疾病。因为啮齿类动物的寿命比较短，所以不允许长期研究不同ED模型类型。雄性大鼠的性反应主要依赖于嗅觉刺激，而人类更多地依赖于视觉和听觉刺激。此外，啮齿类动物不能完全理解阴茎勃起反应的含义，电刺激和成功插入雌性大鼠阴道分别引起的阴茎勃起也是有所不同的，而事实上，啮齿类动物通过交配和电刺激引起的勃起反应与人类的也是有区别的。尽管如此，啮齿类动物模型对人类仍具有较高的可预测性。鉴于上述种种原因，啮齿类动物目前被作为ED研究的最常用的动物模型。

二、勃起反应的评价方法

海绵体内压（ICP）检测是阴茎勃起研究的重要方法，电刺激麻醉状态大鼠的周围神经，并测量其ICP的变化。阿朴吗啡（APO）具有诱发勃起的药理作用，雄性大鼠注射APO后可引起阴茎勃起反应[9]。Quinlan等[10]对CN损伤动物模型进一步研究后提出，通过测量ICP和平均动脉压（MAP）的变化来检测CN损伤对勃起反应的影响。动态海绵体造影和阴茎海绵体测压提供了海绵体平滑肌功能评价的指标[11]。电刺激或化学刺激特定的大脑区域也可以引起阴茎勃起，内侧视前区和下丘脑室旁为研究调节阴茎勃起行为的中枢神经系统提供了更高级的神经中心。口服、皮下、动脉内、静脉内和海绵体等不同的给药途径已被用于研究它们对阴茎勃起的影响。

随着蛋白质标记、免疫组化和Western blot分析等先进技术的发展，改进了对ED功能和形态学的评估，并增加了对ED病理生理学的理解[11-13]。动物模型和人类的海绵体组织通过原代细胞培养，可以增加我们对勃起功能细胞机制的了解[14]。在体外实验中，利用重组载体敲除（KO）蛋白质或酶，以及利用间充质干细胞进行自体细胞培养，也增加对病理生理学的认识[15]。

三、损伤模型的分类

（一）CN损伤模型

Walsh和Donker[16]首次报道了骨盆手术对勃起神经通路的影响，前列腺癌根治术（RP）可以导致ED。有研究表明，RP后性功能恢复情况与术前有效的保护神经血管束有密切的联系，尽管技术不断的创新和进步，但是CN在保留神经（NS）的RP中仍然不可避免的被暴露和损伤，并导致ED。由于这个原因，许多科学家已经建立了多种CN损伤的动物模型，每种CN损伤模型都有其优点和缺点，实际应用中应根据需要选择。

CN损伤模型的类型 Quinlan等[10]第一次利用啮齿类动物模型研究阴茎勃起，利用电刺激诱导并测量大鼠的最大ICP，并建立了CN损伤模型的各种技术[17]。牵拉、挤压、切断、冷冻和切除CN等不同CN损伤方式已在各种动物模型中被广泛应用[18]。

CN挤压模型可由止血钳、动脉夹等外科器械引起，造成CN机械压迫，挤压时间为15s～2min[19,20]。在CN挤压模型中，利用止血钳挤压CN 2min，发现ICP降低，盆大神经节（MPG）和CN中的神经元型一氧化氮合酶（nNOS）阳性神经纤维的含量显著减少[19]；Sezen等[20]在CN损伤研究中也发现了ICP降低和阴茎背神经中nNOS阳性神经纤维的含量减少。

冷冻是另一种CN损伤方式，利用干冰冷冻损伤CN，早期出现ICP降低和nNOS阳性神经纤维的含量减少，但是3个月后阴茎血流动力学和组织学恢复正常[21]。由于CN冷冻损伤保持相对完好的CN鞘，它在损伤的CN两端提供了一个潜在的神经轴突再生的神经通路，从而恢复勃起功能。

游离性CN损伤的动物模型，从MPG到前列腺尖部游离CN，此过程中没有CN挤压和切断，虽然早期发现ICP和nNOS阳性神经纤维的含量减少，但是8周后它们明显恢复[22]，这种动物模型为我们解释了CN游离导致CN损伤性ED的机制。

最近，朱建强等[23]在电凝损伤CN动物模型的研究中发现，ICP/MAP下降，阴茎背神经中神经丝蛋白的含量减少，并且海绵体组织纤维化，术后第1周电刺激CN后阴茎无勃起反应，ICP处于基线水平，虽然4周后ICP有了一定程度的提高，但仍显著低于对照组。电凝损伤可以产生局部高温，造成蛋白质变性、组织缺血及炎症反应，对CN产生严重的损伤，导致ED。

CN切断和切除是比较严重的CN损伤模型，CN切断损伤使用剪刀直接切断CN[24]，而CN切除损伤需要切除一段CN[25]，从理论上讲，CN切除比CN切断对勃起功能的影响更严重。CN鞘连续性中断，缺乏神经再生轴突到达靶组织的神经通路，并导致不可逆的损害。此外，CN鞘损伤还可以导致阴茎平滑肌细胞凋亡，并引起静脉闭塞性阴茎勃起功能障碍。

1. 单侧CN损伤：Carrier等[26]发现单侧CN损伤与双侧CN损伤相比，6个月后前者nNOS阳性神经纤维的含量更多，ICP数值更高，勃起反应更好。连续的神经纤维可以合成神经营养因子，并维持其支配器官的结构和功能[27]，在CN挤压和CN冷冻动物模型中也发现CN损伤后轴突再生的现象[20,21]。然而，单侧CN切断模型中对侧CN未损伤，可能会对损伤侧神经的再生和恢复产生影响，并混淆实验结果。

2. 双侧CN损伤：相比之下，双侧CN切断后阴茎勃起功能迅速丧失，并且在整个实验期间勃起功能完全丧失[10]。Zhang等[28]在双侧CN损伤模型中发现，nNOS阳性神经纤维的含量在第3周时显著减少，6月后神经仍未出现再生。CN切断2周后海绵体平滑肌和内皮细胞的细胞凋亡的组织学表现是显而易见的[29]，可能是由于调节平滑肌细胞凋亡的sonic hedgehog（SHH）减少造成的[30]。SHH被抑制之后阴茎海绵体平滑肌细胞凋亡增加12倍，SHH治疗CN损伤的动物模型后，海绵体平滑肌未出现明显损伤性变化。因此，CN切断引起的ED，可能是由于神经破坏、内皮细胞和平滑肌功能障碍造成的。

Jin等[31]在CN损伤导致ED的动物模型中，进一步说明了阴茎血流动力学紊乱和海绵体超微结构改变，与对照组比较，ICP明显降低，纤维化因子表达增强，凋亡细胞和磷酸化Smad2阳性的海绵体内皮细胞及平滑肌细胞数目增加，CN挤压造成勃起反应持续4W减弱，CN切断引起的ED持续12W。

3. 转基因CN损伤模型：NOS和一氧化氮（NO）在阴茎勃起过程中起到重要作用。目前，研究发现NO是激活NOS的重要因素，nNOS和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）对诱导型一氧化氮合酶（iNOS）具有重要作用。有研究认为nNOS通过激活中枢和外周系统，在勃起反应的起始阶段起到重要作用，而eNOS促进血液流入海绵体窦，引起阴茎勃起[32]。基因工程小鼠缺乏nNOS和eNOS，ICP明显降低，西地那非对nNOS基因KO小鼠增加勃起反应的作用减弱[33]。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）转基因小鼠出现自然勃起数目增加，并且胶原蛋白和弹性蛋白的表达也增加[34]。TNF-α是一个促炎细胞因子，可以抑制eNOS表达，TNF-α基因KO小鼠的eNOS表达增强，有利于阴茎勃起。

最近研究认为，iNOS具有防止组织纤维化和平滑肌细胞凋亡的内源性防御机制。Ferrini等[35]发现iNOS可以降低体内组织的纤维化，并维持NO的药理学水平。在iNOS基因KO小鼠中，体内海绵体平滑肌/胶原的比例和平滑肌含量减少，这与ED动物模型中的结果一致。

（二）动脉结扎模型

阴茎动脉供血不足已被证明是ED的常见原因。髂内-阴部内-阴茎海绵体动脉系的动脉粥样硬化或创伤性动脉闭塞性疾病可以导致阴茎血流灌注压降低，改变阴茎血流动力学，导致ED的发生、发展。有研究表明，ED的出现早于冠心病[36]。结扎大鼠双侧髂内动脉可以直接引起ICP降低，但1个月后勃起明显恢复[37]。免疫组化染色显示阴茎背神经和海绵体神经中nNOS阳性神经纤维的含量减少，而聚合酶链反应（RT-PCR）提示初期的TGFβ-1表达上调。与其他器官缺血性变化一样，也会出现成纤维细胞和肌成纤维细胞损伤、脂肪变性、胶原沉积和血窦塌陷等典型变化[38]。de Young等[39]也有类似的报道，海绵体组织中蛋白质表达和血管内皮的完整性发生改变，平滑肌纤维和血管内皮生长因子（VEGF）的表达减少，CN中nNOS阳性神经纤维的含量也显著减少。

急性夹闭单侧阴部内动脉或阴茎动脉可引起对侧阴部内动脉血流代偿性增加，只影响同侧ICP，但双侧夹闭阴部内动脉引起双侧ICP显著降低，严重影响勃起反应[40]。然而慢性阴部内动脉流入障碍对勃起功能影响较小，可能是由于阴茎周围侧枝循环建立缓解了这种缺血的改变。结扎髂内动脉后海绵体内注射VEGF，发现内皮细胞出现肥大和增生，血管生成作用显著增强，可以促进勃起功能的恢复[41]。

（三）脊髓损伤模型

与CN损伤模型相比，脊髓损伤（SCI）和其他神经系统损伤的ED动物模型报道比较少。Allard和Edmunds等[42]在SCI动物模型中发现，可以出现类似射精节律性的球海绵体肌和阴茎勃起收缩。脊髓横断比未受损伤脊髓的勃起反应更强，并且肌电图检测发现球海绵体肌反射增强。Temeltas等[43]和Rivas等[44]在SCI模型中也发现了ICP的显著增高。

四、结语

各种动物模型的开发和建立已在ED领域取得显著进步。通过对勃起生理和再生医学的研究，使我们对人类勃起功能障碍有了深刻的了解，也增加了对导致ED的病理生理学的理解，并可用于探索和测试新的治疗ED的药物和手术方式的效果。

虽然使用啮齿类动物模型研究ED仍将是较为理想的动物模型选择，但是我们需要认识到，啮齿类动物的年龄、种类和品系可能会影响和干扰药物的作用，从而对研究结果产生影响。开发更加符合人类病理生理学的损伤性ED动物模型将成为推动ED治疗研究的重要工具。

致谢：本课题受国家自然科学基金资助项目（30901489）; 山东省科学技术发展计划资助项目（2011GGH21813）

模型,动物; 勃起功能障碍

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（2013-11-18收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.03.019

R 698.1