多花黄精嫩茎与根茎芽离体培养技术

周新华，曾满生，肖智勇，李峰卿，周志兰，钟秋平

(1.中国林业科学研究院 亚热带林业实验中心，江西 分宜 336600；2.宜春市林业科学研究所，江西 宜春 336000)

多花黄精Polygonatum cyrtonemaHua是百合科黄精属药食同源的多年生草本植物，其根茎是我国传统大宗药材，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾等功效[1-2]。多花黄精主要分布在四川、贵州、湖南、湖北、河南、江西、安徽、浙江、福建、广东等省份，生长在林下、灌丛或山坡阴处，海拔500～2 100m[3]。在人工栽培中由于受种子收集难度大、发芽率低下、育苗周期长等因素影响，多花黄精通过有性繁殖的方式无法满足生产需要。而无性繁殖作为保持母本优良性状和快速繁育的重要手段，可有效地解决优良种源性状固定和利用这一难题。与扦插、嫁接等常规无性繁殖方法相比，组织培养具有不受季节、取材数量等因素制约的优势，可在短期内规模繁殖性状稳定的优良种苗[4-5]。利用组培手段培育出来的种苗，不仅保持了母本的优良性状、增加了繁殖材料、缩短了育苗周期，还可为建立优良苗圃繁育基地节省育苗成本。因此，开展多花黄精的离体组织培养和芽增殖技术研究非常有必要。

国内的相关研究集中于多花黄精的芽体外发生、根茎芽增殖和株体生根等组织离体培养技术[6-11]，结果表明不同外植体材料的组织部位、年龄和培养基成分是影响多花黄精组培成功与否的关键。植物材料组织培养按器官发生途径，通常可分为器官直接发生途径和器官间接发生途径2种类型。直接发生途径以芽为外植体，获得的植株具有稳定性好、自然变异频率低、适应性强和移栽成活率高等优点[12]。但芽增殖系数不高一直是制约多花黄精器官直接再生组织培养途径的主要因素，因此探索提高芽的诱导和增殖效率是当前多花黄精组织培养过程中迫切需要解决的问题。

本试验中以野生多花黄精的嫩茎和休眠芽为材料，进行植物组织器官直接发生的离体培养技术研究，探索适合大岗山山区野生多花黄精嫩茎和根茎芽增殖的最优培养基，以期为构建多花黄精高效、稳定的组织培养再生体系，规模化生产多花黄精组培苗提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以江西省分宜县中国林业科学研究院亚热带林业实验中心年珠林场大岗山山区选育的生长性状表现优良的野生多花黄精为研究对象，选取嫩茎和休眠根茎芽2种外植体为研究材料。该批植株是于2010年从大岗山山区选育移栽到试验基地的试验材料，2012年底将多花黄精块茎移至亚林中心生物工程部进行沙藏处理，方便取材，嫩茎取材约10cm作为外植体诱导材料，根茎芽从块茎上切取新萌芽。

1.2 试验方法

1.2.1 灭 菌

先用体积分数为75％酒精进行表面灭菌，然后采用15％次氯酸钠和0.1％氯化汞进行深度灭菌，酒精灭菌处理时间为分别15、30s，次氯酸钠和氯化汞灭菌处理时间分别为6、8、10min，灭菌采用多因素灭菌试验设计，共计12个处理，每个处理重复3次。将取得的长约10cm的嫩茎材料，剪成长3～5cm(1～2节)的细段放入烧杯中，用洗洁精浸泡洗涤15min，然后用自来水冲洗1h以上。之后在超净工作台上进行灭菌试验，处理完成后用无菌水冲洗4次以上，接入MS培养基中，30d后统计污染情况，并算出每个处理相应的无菌率。

无菌率=无菌瓶数/接种总瓶数。

1.2.2 嫩茎和根茎芽诱导

选用无外源激素的MS、White和H等3种基本培养基开展嫩茎和根茎芽的萌发试验，每个处理重复3次。灭菌后的嫩茎和根茎芽分别接种在上述3种培养基中，45d后统计萌发的芽数，并计算平均萌发芽数。

平均萌发芽数=萌发的总芽数/接种的总瓶数。

1.2.3 不定芽诱导

MS培养基的硝酸盐含量较其它培养基高，被广泛应用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果较好[13]。以MS培养基为基础培养基，试验处理采用萘乙酸(NAA)和激动素(KT)2种植物生长激素，0.5～2.0mg/L不同质量浓度激素处理的双因素试验，共计4个处理，每个处理重复3次。将根茎芽剥去外面2～4层后，洗洁精浸泡洗涤15min，自来水冲洗1h以上，超净工作台上用体积分数为75％的酒精处理15s，用无菌水冲洗3次，用0.1％的氯化汞处理10min，用无菌水冲洗4次以上，剥去外面1层，接种在不同处理的MS培养基中。45d后统计萌发不定芽的数量，并计算平均增殖数。

平均增殖数＝萌发不定芽总数/接种总芽数。

1.2.4 培养条件

组培室培养条件为：温度控制在(24±2)℃，光照强度控制在1 500～2 000 lx，每天光照时间12h，湿度控制在70％左右。

1.3 数据分析与处理

采用SPSS18.0统计分析软件进行方差分析和多重比较。多重比较采用显著系数0.05上的Duncan多范围检验，所有检验数据都在同一量纲上进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌处理对外植体灭菌效果的影响

先以酒精处理进行表面灭菌，然后以次氯酸钠或氯化汞处理进行深度灭菌的混合处理灭菌方法，不同外植体灭菌处理的灭菌效果不同(见表1)。表1中结果显示，75％的酒精处理30s、0.1％氯化汞处理10min外植体灭菌效果最好，无菌率高达73.2％；其次是75％的酒精处理30s、0.1％氯化汞处理8min，外植体消毒无菌率达到64.8％。氯化汞是一种有剧毒的重金属杀菌剂，能使蛋白质变性，使酶失活，在常用消毒剂中其灭菌效果最好[12]，本试验中外植体材料来源于地下部，带有大量的细菌和真菌，使用其它消毒剂恐难以达到较好的灭菌效果。但氯化汞的重金属残留会对植物造成伤害，废液乱弃也会对环境造成危害，故在使用氯化汞进行灭菌时应增加对外植体的冲洗次数(最好6次以上)，废弃液采用硫化钠处理，防止环境污染。

表1 不同灭菌处理的灭菌效果†Table 1 Effect of different sterilization treatments

2.2 不同培养基对腋芽萌发的影响

外植体灭菌后接种在无外源激素的MS、White和H 3种基本培养基上进行腋芽萌发试验，培养45d后，统计外植体萌发的腋芽数，并计算单个外植体的平均萌发数，结果见表2。表2中结果显示，MS培养基上的外植体腋芽萌发最好，平均萌发数嫩茎1.0个、根茎芽1.5个；其次是White培养基，腋芽平均萌发数嫩茎0.5个、根茎芽1.0个。就外植体不同取材部位而言，根茎芽的萌发能力要明显大于嫩茎部位，这与外植体材料不同部位自身的萌发能力有关。不同外植体萌发的腋芽见图1A和图1B。

2.3 不同激素质量浓度对不定芽诱导的影响

将灭菌后的根茎芽接种在含有不同质量浓度激素的MS培养基上，培养45d后，观察统计诱导不定芽数量，并计算平均单个根茎芽上诱导出的平均不定芽数，统计结果见表3。试验结果表明，NAA和KT单独使用时，以NAA 2.0mg/L和KT 2.0mg/L的不定芽诱导效果最好，2个处理单个根茎芽能诱导出不定芽的数量分别为2.2和2.7个。在此基础上，保持NAA和KT激素质量浓度在同等水平，进行NAA和KT的组合对根茎芽诱导试验，激素组合NAA 1.5mg/L＋KT 1.5mg/L对根茎芽的诱导效果最佳，单个根茎芽的平均不定芽诱导数达6.6个，使用NAA和KT激素组合均比单独使用NAA和KT对不定芽的诱导效果要好。激素组合诱导出的不定芽见图1C和图1D。

表2 不同培养基中外植体萌发结果Table 2 Explants germination status in different media

3 结论与讨论

3.1 灭菌方法的选择

为方便试验获取嫩茎和根茎芽材料，于11月底将黄精根茎从苗圃地中挖起移至室内沙藏处理，沙藏处理时间长短和沙粒的灭菌与否对外植体灭菌后的污染率影响较大。由于本试验中外植体材料长时间埋藏在沙中，不可避免取材带有大量的细菌和真菌，这是获取无菌组织培养材料的一大障碍。为克服这一困难，本试验中在获取无菌材料时，先将材料用洗洁精浸泡洗涤，然后用自来水冲洗1h以上，转移到超净工作台上后用75％的酒精进行表面灭菌，再选用消毒能力最强的0.1％氯化汞进行灭菌处理效果较好。为减少重金属残留对外植体材料的毒害作用，在灭菌之后用无菌水冲洗6次以上较好。

表3 MS培养基上不同质量浓度激素处理对不定芽诱导的影响Table 3 Effect of different mass concentration treatments of hormones in MS medium on adventitious buds induction

图1 多花黄精组织培养腋芽萌发和不定芽诱导过程Fig.1 Axillary bud germination and adventitious bud differentiation process in tissue culture of P.cyrtonema

3.2 基本培养基和材料部位的选择

在组织培养过程中，外植体分化和生长受多种因素的综合影响，其中培养基的成分和含量以及外植体的取材部位选择，对组织培养植物的发生过程和生长形态均有着显著影响。本试验中通过对外植体在无外源激素的MS、White、H 3种基本培养基上的腋芽萌发试验，得出MS基本培养基最有利于外植体材料腋芽的萌发；通过对嫩茎、根茎芽在MS、White、H培养基上的腋芽萌发试验，得出根茎芽的萌发能力要显著好于嫩茎的萌发能力。因此，以MS为基本培养基、根茎芽为材料有利于多花黄精组织离体培养技术的探索。

3.3 不同激素质量浓度的选择

芽增殖过程中，最适合腋芽萌发的基本培养基是MS培养基。休眠芽是诱导不定芽的理想材料之一，芽诱导的效果受到材料基因型、树龄、培养基、培养条件等多方面因素影响[14-18]。本试验中通过对根茎芽在含有不同质量浓度NAA和KT的MS培养基上的不定芽诱导试验，最终确定最适不定芽诱导的培养基为MS＋NAA 1.5mg/L ＋KT 1.5mg/L。

在植物组织离体培养过程中，影响离体组织生长发育的因素较多。本试验中着重对基本培养基、外植体选材部位和外源激素种类和质量浓度对黄精植物组织离体材料的生长和增殖情况的影响进行了初步探索。在试验设计上，由于试验规模和时间限制，未开展对培养温度、光照以及其它基本培养基和多种不同激素及其质量浓度组合对多花黄精生长和芽增殖的影响探索，在后续研究中可以采用正交设计或均匀设计方法等，利用快速高效的手段开展进一步的探索。

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