低氧对小鼠学习记忆力及脑中tau蛋白磷酸化的影响*

陈 媛，虞立霞，洪 燕△，牛 超，高婧玮，金 宏，汪雪兰，汪 海△

（1.军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津300050；2.中山大学中山医学院，广东广州510080）

在高原环境中，低氧是主要的刺激因子，中枢神经系统是对缺氧最为敏感的系统［1］。目前，有大量研究表明高原环境对人的认知功能如短时记忆、注意广度、思维判断能力等产生明显影响［2］。急性低氧暴露后海马、皮质和纹状体神经元的凋亡可能导致动物空间记忆能力的下降，对神经系统造成损伤［3］，有研究发现在模拟海拔4 000 m低氧暴露1 d后大鼠脑中小胶质细胞的形态发生明显改变［4］，而关于慢性低氧对学习记忆能力及行为能力的影响报道较少，对其机制的研究尚处于探索阶段。本实验模拟高原海拔5 500 m的环境，检测不同低氧时间对小鼠认知能力和活动能力的影响及神经元重要结构蛋白tau蛋白磷酸化程度的改变，以期探讨低氧导致认知功能改变的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取成年雄性昆明小鼠45只，32～35 g，由军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物中心提供。在普通动物房中适应性饲养一周，剔除体重过轻或过重的小鼠。室温维持在24～27℃，湿度为50%～65%，自由摄食，自然光照。

1.2 高原低氧模型

将实验小鼠随机分成 4组（n＝10）：对照组（Control）、8 h低氧暴露组（8 h）、7 d低氧暴露组（7 d）、28 d低氧暴露组（28 d）。将低氧暴露组动物置于低压舱内，模拟海拔高度为5 500 m（380 mmHg），匀速升至固定高度后保持8 h，期间自由摄食。对照组置于另一动物舱内，但不低氧，温湿度与低氧组基本一致。从第1天开始每隔4 d在上舱前称体重，记录体重数据。下仓后立即对每组动物进行旷场实验、避暗实验和蛋白免疫印迹检测，避免常氧环境对其影响。

1.3 蛋白免疫印迹

将小鼠处死后，冰上取脑，分离出海马、皮层，加入RIPA裂解液，冰上裂解，静置45 min后于 4℃10 000 r／min离心10 min，取上清，蛋白定量后加入上样缓冲液煮沸5 min。用聚丙烯酰胺凝胶电泳，在电压100 V的条件下电泳2 h。电泳结束后将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移至PVDF膜（Millipore），电压80 V，1 h。2%BSA室温封闭 1 h，加入一抗，4℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，ECL化学发光液显色。

实验中所用一抗兔源抗鼠pS396、pT181、pS262购自Abcam，鼠源抗鼠 tau46、兔源抗鼠 tubulin购自Santacruz，鼠源抗鼠 AT8（pS202／T205）购自 Pierce。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗或羊源抗兔二抗购自 Sigma公司，ECL（enhanced chemiluminescent）试剂盒从Advansta公司购买。

1.4 避暗实验

避暗箱（购自中国医学科学院药物研究所，型号：SBA-2小鼠避暗程序自动控制仪）由两个测试箱组成，分为明室和暗室两部分。暗室可独立通电，底部铜栅通36 V、50 Hz交流电。测试时将鼠背对洞口放入明室，小鼠进入暗室则受到电击，避暗仪自动记录5 min内小鼠进入暗室的次数，即为错误次数，记录首次进入暗室的时间，即为避暗潜伏期。避暗箱实验步骤（1）适应环境：第1天将各组小鼠从明室放入测试箱中，令其在不通电的情况下自由穿梭，适应环境5 min，然后取出。第2天向暗室底部铜栅通36 V，50 Hz交流电，再将小鼠背对洞口放入明室，小鼠进入暗室则受到电击，电击1次即拿出。（2）测试：第3天在同一时间重复前一天实验，将暗室通电，小鼠放于明室，数据采集系统自动记录第1次进入暗室的时间（潜伏期）和5 min内受到的电击次数（错误次数）。若小鼠5 min未进入暗室，错误次数记为0次，潜伏期记为300 s。

1.5 旷场实验

旷场箱为100 cmⅹ100 cmⅹ100 cm的黑色箱体，底面有25个方格（20 cmⅹ20 cm），上面敞开，中央区域为9个方格。将小鼠置于旷场箱中央区域，开始计时，记录小鼠前肢跨出中央区域的时间，记为潜伏期。观察记录其横穿的格子数和直立次数，当其身体直立双臂离开地面1 cm算为一次。5 min后停止实验，将小鼠拿出，用酒精擦拭旷场箱挥干后，进行下一只小鼠的实验。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 低氧不同时间小鼠体重变化

实验前各组小鼠体重无差异，低氧处理的前两周低氧组小鼠体重增长速度与对照组相比较慢，28 d低氧暴露后接近对照，说明对照组与低氧组之间小鼠的生长发育未见明显差异。

Fig.1 Trend of body weight variations of control and hypobaric hypoxia（HH）groups（¯x±s，n＝10）

2.2 不同低氧时间对小鼠短期记忆力的影响

急性低氧8 h后，小鼠避暗潜伏期有所下降，连续低氧28 d后显著降低（P＜0.05），错误次数随着低氧时间的增加而增多（P＜0.05）。说明急性低氧对小鼠的短期学习记忆能力有损伤，慢性低氧较急性低氧严重（表1）。

2.3 不同低氧时间对小鼠行为能力的影响

8 h低氧暴露后穿格数和直立次数呈降低趋势，7 d后略有升高，但均不具有统计学意义。28 d低氧暴露后在中央区域的停留时间显著延长（P＜0.05），穿格数和直立次数显著降低（P＜0.05，表2）。*

Tab.1 Effects of hypoxia on the latency period and number of mistakes in passive avoidance test（¯x±s，n＝10）

Tab.2 Effect of hypoxia on the exploratory and locomotors activity in open field test（¯x±s，n＝10）

2.4 不同低氧时间对tau蛋白磷酸化的影响

在海马组织中，随着低氧暴露时间的增加tau蛋白Thr181、Ser202／T205和Ser396位点的磷酸化程度有上升趋势，Thr181、Ser202／T205在 28 d低氧暴露后显著升高分别为 0.91±0.11、0.53±0.05（P＜0.05）；低氧暴露 8 h、7 d时，Ser262磷酸化程度未发生明显改变，而28 d后其磷酸化程度明显升高到0.86±0.09（P＜0.05），为常氧环境的 3倍。皮层中的磷酸化Thr181、Ser262含量在低氧暴露7 d后达到最高，分别为 0.45±0.07、0.66±0.08（P＜0.05），28 d后略有下降（P＜0.05）；Ser202／T205位点的磷酸化水平随着低氧暴露时间增加而升高，在28 d时达到最高为 0.51±0.04（P＜0.05，图 3）。

Fig.3 Influence of hypoxia on the expression of phosphorylated tau in cortex and hippocampus

3 讨论

低压低氧引起脑损伤及功能障碍目前已得到证实。有研究发现急性低氧暴露可增加脑血管微循环障碍［5］，也有研究显示急性低压低氧环境导致的空间记忆下降与脑水肿及氧化应激系统失衡有关［6］。此前的研究主要集中在急性低氧造成的血管损伤，关于亚急性、慢性低氧对神经系统影响的相关报道较少，其具体机制也尚未完全明了。本研究通过避暗实验检测模拟海拔5 500 m不同低氧暴露对小鼠被动逃避能力的影响，28 d低氧暴露后小鼠的避暗潜伏期与对照组相比明显缩短，平均错误次数增加，提示慢性间歇性低压低氧会对其短期记忆能力造成损害。旷场实验结果显示，随着低氧时间增加，小鼠在中央区域的活动时间增加，穿格、直立次数降低，说明28 d低氧暴露后小鼠的神经系统处于抑制状态，兴奋性降低，导致小鼠的自发活动能力下降。

tau蛋白作为神经系统中起着重要支撑作用的结构蛋白，参与细胞骨架的形成，与微管结合后协助微管正确组装，并维持其稳定，当其发生过度磷酸化将可能形成神经纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）进而导致神经元退行性病变及其功能障碍，影响认知能力［7］。目前已发现的 tau蛋白丝／苏氨酸位点有79个，在促进和稳定微管结合能力方面作用比较大的有30多个［8］，本研究选取的位点分别位于脯氨酸富含区、重复序列区域和羧基端区域。Western blot结果显示tau蛋白上多个位点的磷酸化程度随着低氧时间的延长而加剧，低氧可引起tau蛋白的多 个 丝／苏 氨 酸 位 点 （Thr181、Ser262、Ser202／Thr205、Ser396）发生过度磷酸化。在海马组织中，与常氧环境相比，Ser262、Thr181、Ser202／Thr205和Ser396位点的磷酸化程度在28 d低氧暴露后均显著升高，其中Ser262位于tau蛋白分子的重复序列区域，属于微管结合区，过度磷酸化会导致tau蛋白从微管上解离，使微管解聚，减弱tau的微管结合能力［9］。Thr181、Ser202／Thr205是脯氨酸富含区的重要位点，过度磷酸化后会促进tau寡聚化，从而加剧神经退行性形变的进程［10］。Ser396位点位于tau的羧基端，这个位点的磷酸化对其形成神经纤维缠结起关键作用［11］。与海马组织中的tau蛋白磷酸化变化趋势不同的是，皮层组织中的tau蛋白磷酸化程度在低氧7 d达到最高，28 d后略有下降，其原因可能是皮层所在的大脑边缘区域是对低氧最敏感的脑区［12］，低氧刺激能导致其在较短时间发生分子水平的改变。而海马是与学习记忆最为相关的结构，慢性低氧对其造成损伤的过程较慢，这也能够从慢性低氧导致动物认知能力和行为活动能力降低体现出来。说明低压低氧刺激使海马和皮层组织中的tau蛋白修饰发生改变，导致神经元产生病理性变化，进而影响小鼠的学习记忆能力。

本研究结果提示tau蛋白过度磷酸化可能是低氧引起小鼠记忆衰退的分子机制之一，并为深入开展相关分子机制研究提供参考。

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